Glioblastoma multiforme'un Translasyonel Ortotopik Modelleri
Summary
Burada, genetiği değiştirilmiş fare modeli tümörlerinden türetilen hücrelerin intrakraniyal enjeksiyonu ile kurulan GBM için klinik öncesi bir ortotopik fare modelini tarif ediyoruz. Bu model, insan GBM’sinin hastalık özelliklerini gösterir. Translasyonel çalışmalar için, fare beyin tümörü in vivo MRG ve histopatoloji ile izlenir.
Abstract
İnsan glioblastoma multiforme (GBM) için genetik olarak tasarlanmış fare (GEM) modelleri, beyin tümörlerinin gelişimini ve ilerlemesini anlamak için kritik öneme sahiptir. Ksenogreft tümörlerinden farklı olarak, GEM’lerde, tümörler immünokompetan bir farede doğal mikro ortamda ortaya çıkar. Bununla birlikte, GBM GEM’lerin preklinik tedavi çalışmalarında kullanımı, uzun tümör gecikmeleri, neoplazm frekansındaki heterojenite ve ileri dereceli tümör gelişiminin zamanlaması nedeniyle zordur. İntrakraniyal ortotopik enjeksiyon yoluyla indüklenen fareler, preklinik çalışmalar için daha kolay izlenebilirdir ve GEM tümörlerinin özelliklerini korur. Neoplastik hücreler tarafından doğrusal nekroz odakları ve insan GBM’sine benzer yoğun vaskülarizasyon gösteren GBM tümörleri geliştiren Rb, Kras ve p53 anormallikleri (TRP) içeren bir GEM modelinden türetilen ortotopik bir beyin tümörü modeli oluşturduk. GEM GBM tümörlerinden türetilen hücreler, vahşi tip, suşla eşleşen alıcı farelere intrakraniyal olarak enjekte edilir ve derece IV tümörleri çoğaltır, bu nedenle GEM farelerinde uzun tümör gecikme süresini atlar ve klinik öncesi çalışmalar için büyük ve tekrarlanabilir kohortların oluşturulmasına izin verir. GBM için TRP GEM modelinin yüksek proliferatif, invaziv ve vasküler özellikleri ortotopik tümörlerde özetlenmiştir ve histopatoloji belirteçleri insan GBM alt gruplarını yansıtmaktadır. Tümör büyümesi seri MRG taramaları ile izlenir. İmmünkompetan modellerde intrakraniyal tümörlerin invaziv doğası nedeniyle, burada özetlenen enjeksiyon prosedürünü dikkatli bir şekilde takip etmek, ekstrakraniyal tümör büyümesini önlemek için esastır.
Introduction
Glioblastoma (GBM; grade IV glioma) en sık görülen ve malign beyin tümörüdür ve mevcut tedaviler etkisizdir ve medyan sağkalım 15 ay1 ile sonuçlanır. Beyin tümörü büyümesi ve patogenezinde rol oynayan karmaşık sinyal yollarını temsil eden güvenilir ve doğru preklinik modeller, GBM için yeni terapötik rejimlerin değerlendirilmesindeki ilerlemeyi hızlandırmak için gereklidir. İnsan beyni tümörü hücre hatlarının bağışıklık sistemi baskılanmış farelerde deri altından implante edildiği fare modelleri, beyin tümörlerinin doğal bağışıklık ortamını yansıtmaz ve terapötiklerin kan-beyin bariyerini geçme yeteneğini değerlendirmek için kullanılamaz2. İdeal olarak, klinik öncesi fare modelleri, çevredeki parankim3’e yüksek düzeyde invazivlik de dahil olmak üzere insan GBM histopatolojisini de yakından yeniden üretmelidir. Genetiği değiştirilmiş fare (GEM) modelleri, sağlam bir bağışıklık sistemi bağlamında tümörler geliştirse de, karmaşık üreme şemaları sıklıkla gereklidir ve tümörler yavaş ve tutarsız bir şekilde gelişebilir4. GEM kaynaklı allogreft modelleri, tümör taşıyan farelerin büyük kohortlarının daha kısa sürede ihtiyaç duyulduğu klinik öncesi terapötik çalışmalar için daha uygundur.
Önceki bir raporda, doğrudan GEM tümörlerinden türetilen ortotopik bir GBM fare modelini tanımladık. GEM’deki tümörigenez, glial fibriler asidik proteini (GFAP) eksprese eden hücre popülasyonlarındaki (öncelikle astrositler) genetik olaylarla başlatılır ve GBM’ye ilerlemeyle sonuçlanır. Bu TRP GEM’ler, GFAP güdümlü Cre rekombinazına maruz kaldıktan sonra T121’i eksprese eden bir TgGZT121 transgeni (T) barındırır. T121 protein ekspresyonu, Rb (Rb1, p107 ve p103) protein aktivitesinin baskılanmasına neden olur. GFAP güdümlü Cre transgeninin (GFAP-CreERT2) birlikte ekspresyonu, tamoksifen ile indüksiyondan sonra yetişkin astrositlere ekspresyonu hedefler. TRP fareleri ayrıca Cre’ye bağımlı bir mutant Kras (KrasG12D; R) alel, reseptör tirozin kinaz yolunun aktivasyonunu temsil eder ve Pten (P)5,6 kaybı için heterozigottur. Reseptör tirozin kinaz (RTK), PI3K ve RB ağlarındaki eş zamanlı gen anormallikleri GBM patogenezinin %74’ünde rol oynar7. Bu nedenle, insan GBM’sinde değiştirilen birincil sinyal yolakları, TRP farelerindeki, özellikle de RTK’ların paylaşılan aşağı akış hedeflerinin aktive edildiği GBM tümörlerindeki mühendislik mutasyonları ile temsil edilir5.
GEM kaynaklı sinjenik ortotopik model, GBM’de anormal yolları hedefleyen kanser terapötiklerini değerlendirmek için bir platform olarak kullanılmak üzere, invazivlik ve alt tip biyobelirteçlerin varlığı da dahil olmak üzere insan beyin tümörlerinin özelliklerini özetleyen bir model olarak doğrulanmıştır. Hücreler, TRP beyinlerinden toplanan tümörlerden kültürlendi ve kortekste intrakraniyal enjeksiyon için stereotaktik ekipman kullanılarak, suşla eşleşen farelerin beynine yeniden implante edildi. Bu preklinik ortotopik fare modeli, yüksek mitotik orana sahip, yüksek hücresel, invaziv, pleomorfik GBM tümörleri geliştirdi ve insan GBM’sinde gözlendiği gibi, neoplastik hücreler ve yoğun vaskülarizasyon ile doğrusal nekroz odakları sergiledi. Tümör hacimleri ve büyümesi in vivo manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile ölçüldü.
Bu yazıda, TRP tümörlerini örnek olarak kullanarak, birincil GBM hücrelerinin veya hücre hatlarının vahşi tip fare beynine intrakraniyal enjeksiyonu için en uygun tekniği tanımladık. Aynı protokol, bağışıklık sistemi baskılanmış fareler ve diğer GBM hücre hatları için uyarlanabilir. Enjeksiyon bölgesinde yetersiz hücre hazırlığı veya hücre sızıntısı gibi yaygın tuzaklardan kaçınmak ve modelin tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini sağlamak için stereotaktik ekipmanı doğru kullanmak için çok önemli ipuçları verilmiştir. Translasyonel amaçlar için, modeli canlı hayvanlarda beyin tümörü büyümesinin MRG tespiti, histolojik karakterizasyon ile doğruluyoruz ve tümör taşıyan farelerde bir tedavi örneği sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
GBM’de yeni terapötik hedeflerin ve yeni tedavi stratejilerinin değerlendirilmesi için preklinik modeller gereklidir. GBM için genetiği değiştirilmiş fare modelleri, otokton bölgede tümör oluşumu avantajına sahiptir, ancak genellikle uzun bir gecikme süresi ve öngörülemeyen tümör büyümesi ile13. GEM modeli tümörler 4-5 aylık bir gecikme gösterir ve görüntüleme, işe alım ve tedavi için ideal zaman aralığı bireysel fareler arasında değişkendir. Ortotopik model, 4…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mükemmel teknik yardım için Sayın Alan E. Kolaga’ya ve cerrahi teknikleri geliştirdiği için Sayın Michelle L. Gumprecht’e minnettarız. Patoloji analizi için Dr. Philip L. Martin’e ve MRI taramaları için Frederick Ulusal Laboratuvarı Küçük Hayvan Görüntüleme Programı’ndan Bayan Lilia Ileva ve Dr. Joseph Kalen’e teşekkür ederiz.
Bu proje tamamen veya kısmen, HHSN261201500003I sayılı Sözleşme kapsamında Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri’nden Federal fonlarla finanse edilmiştir. Bu yayının içeriği, Sağlık ve İnsani Hizmetler Bakanlığı’nın görüşlerini veya politikalarını yansıtmak zorunda değildir ve ticari isimlerin, ticari ürünlerin veya kuruluşların belirtilmesi ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez.
Materials
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
Referências
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (44), 17933-17938 (2013).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G. Glioblastoma: defining tumor niches. Trends in Cancer. 1 (4), 252-265 (2015).
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J. Mouse Models of Experimental Glioblastoma. Gliomas. , (2021).
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19 (2020).
