चूहों में आंशिक हेपेटेक्टोमी के बाद हेपेटोसाइट्स को पुनर्जीवित करने का अलगाव
Summary
लिपिड से भरे हेपेटोसाइट्स यकृत पुनर्जनन में अंतर्निहित होते हैं लेकिन आमतौर पर घनत्व-ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन पर खो जाते हैं। यहां, हम एक अनुकूलित सेल अलगाव प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो स्टीटोटिक हेपेटोसाइट्स को बरकरार रखता है, जिससे चूहों में आंशिक हेपेटेक्टोमी के बाद हेपेटोसाइट्स को पुनर्जीवित करने की प्रतिनिधि आबादी होती है।
Abstract
चूहों में यकृत पुनर्जनन की जांच के लिए आंशिक हेपेटेक्टोमी का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, लेकिन डाउनस्ट्रीम एकल-कोशिका अनुप्रयोगों के लिए व्यवहार्य हेपेटोसाइट्स की उच्च पैदावार का अलगाव चुनौतीपूर्ण है। चूहों में सामान्य यकृत पुनर्जनन के पहले 2 दिनों के दौरान हेपेटोसाइट्स को पुनर्जीवित करने के भीतर लिपिड का एक चिह्नित संचय देखा जाता है। यह तथाकथित क्षणिक पुनर्जनन से जुड़े स्टीटोसिस (टीआरएएस) अस्थायी है लेकिन आंशिक रूप से प्रमुख प्रोलिफेरेटिव चरण को ओवरलैप करता है। घनत्व-ढाल शुद्धिकरण प्राथमिक हेपेटोसाइट्स के अलगाव के लिए अधिकांश मौजूदा प्रोटोकॉल की रीढ़ है। चूंकि ढाल शुद्धिकरण कोशिकाओं के घनत्व और आकार पर निर्भर करता है, इसलिए यह गैर-स्टीटोटिक को स्टीटोटिक हेपेटोसाइट आबादी से अलग करता है। इसलिए, फैटी हेपेटोसाइट्स अक्सर खो जाते हैं, जिससे गैर-प्रतिनिधि हेपेटोसाइट अंश उत्पन्न होते हैं।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल उनकी लिपिड सामग्री की परवाह किए बिना हेपेटोसाइट्स को पुनर्जीवित करने के विवो अलगाव के लिए एक आसान और विश्वसनीय विधि का वर्णन करता है। नर सी 57बीएल /6 चूहों से हेपेटोसाइट्स को क्लासिक दो-चरण कोलेजनेज छिड़काव दृष्टिकोण द्वारा हेपेटेक्टोमी के 24-48 घंटे बाद अलग किया जाता है। एक मानक पेरिस्टालिक पंप पोर्टल नस के माध्यम से बहिर्वाह के साथ प्रतिगामी छिड़काव तकनीक का उपयोग करके कैथेटराइज्ड अवर वेना कावा के माध्यम से गर्म समाधानों को अवशेष में चलाता है। हेपेटोसाइट्स को ग्लिसन कैप्सूल से उनकी रिहाई के लिए कोलेजनेज द्वारा अलग किया जाता है। धोने और सावधानीपूर्वक सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, हेपेटोसाइट्स का उपयोग किसी भी डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। अंत में, यह पेपर चूहों में आंशिक हेपेटेक्टोमी के बाद हेपेटोसाइट्स को पुनर्जीवित करने की प्रतिनिधि आबादी के अलगाव के लिए एक सीधी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक का वर्णन करता है। विधि फैटी यकृत रोग के अध्ययन में भी सहायता कर सकती है।
Introduction
जिगर बड़े ऊतक हानि के बाद भी खुद को पुनर्जीवित कर सकता है। इस अद्वितीय पुनर्योजी क्षमता को आंशिक (70%) हेपेटेक्टॉमी के प्रयोगात्मक मॉडल द्वारा स्पष्ट रूप से चित्रित किया गया है, जिसे पहली बार 1931 में हिगिंस और एंडरसन द्वारा चूहों में वर्णित किया गयाथा। इस मॉडल में, यकृत के 70% को बड़े यकृत लोब को काटकर जानवरों से शल्य चिकित्सा द्वारा हटा दिया जाता है। शेष लोब तब सर्जरी के बाद लगभग 1 सप्ताह के भीतर मूल यकृत द्रव्यमान को बहाल करने के लिए प्रतिपूरक हाइपरट्रॉफी के माध्यम से बढ़ते हैं, हालांकि मूल यकृत वास्तुकला 2,3 की बहाली के बिना। ऊतक हटाने की अलग-अलग मात्रा के साथ अतिरिक्त हेपेटेक्टॉमी विकसित की गई है, जैसे कि 86% -विस्तारित हेपेटेक्टोमी जहां यकृत अवशेष ठीक होने के लिए बहुत छोटा है, अंततः पोस्टहेपेटेक्टोमी यकृत विफलता (पीएचएलएफ) और बाद में 30% -50% जानवरों में मृत्यु हो जाती है। ये मॉडल सामान्य और असफल यकृत पुनर्जनन के अध्ययन को सक्षम करते हैं, जो कि कटे हुए ऊतक की मात्रा पर निर्भर करता है (चित्रा 1)।
यद्यपि हेपेटेक्टॉमी के माउस मॉडल का उपयोग कई वर्षों से सफलतापूर्वक किया गया है, केवल हाल ही में एकल-कोशिका स्तर पर गहरी अंतर्दृष्टि के लिए अधिक उन्नत विश्लेषणात्मक तरीकों की अनुमति दी गई है। इनमें से अधिकांश विधियों के लिए, हालांकि, व्यक्तिगत हेपेटोसाइट्स की उपस्थिति एक बुनियादी शर्त है। प्राथमिक हेपेटोसाइट्स के अलगाव के लिए अधिकांश प्रोटोकॉल मलबे और गैर-पैरेन्काइमल, साथ ही मृत कोशिकाओं 7,8,9 से व्यवहार्य हेपेटोसाइट्स को अलग करने के लिए दो-चरण कोलेजनेज छिड़काव तकनीक और बाद में घनत्व-ढाल शुद्धिकरण पर आधारित हैं। इस विधि को पहली बार बेरी और फ्रेंड द्वारा 196910 में वर्णित किया गया था और 1972 11,12 में सेग्लेन और सहयोगियों द्वारा अनुकूलित किया गया था। हालांकि, चूंकि ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन कोशिकाओं के घनत्व और आकार पर निर्भर करता है, लिपिड से भरे हेपेटोसाइट्स अक्सर मानक शुद्धिकरण के दौरान खो जाते हैं। जबकि इस तरह के नुकसान कई शोध प्रश्नों के लिए नगण्य हो सकते हैं, यह प्रारंभिक यकृत पुनर्जनन के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू है। पहले 2 दिनों के दौरान, पुन: उत्पन्न माउस यकृत के भीतर हेपेटोसाइट्स लिपिड जमा करते हैं, जिससे आकार में वृद्धि होती है और घनत्व में गिरावट आती है। यह क्षणिक पुनर्जनन से जुड़े स्टीटोसिस (टीआरएएस) पुनर्योजी ईंधन प्रदान करने का कार्य करता है और अस्थायी है, लेकिन आंशिक रूप से प्रमुख प्रोलिफेरेटिव चरण को ओवरलैप करता है और यकृत लोब्यूल्स के भीतर असमान रूप से वितरित होता है – यकृत की कार्यात्मक इकाइयां13,14। विस्तारित 86% -हेपेटेक्टोमी के बाद, हालांकि, टीआरएएस भी होता है लेकिन बना रहता है, क्योंकि पुनर्जनन रुका हुआ है और लिपिड कोऑक्सीकरण नहीं किया जा रहा है। इसलिए, 70% या 86% -हेपेटेक्टॉमी के बाद हेपेटोसाइट्स के ढाल-शुद्धिकरण से गैर-प्रतिनिधि अंश उत्पन्न होंगे, क्योंकि अधिकांश लिपिड-लदे हेपेटोसाइट्स उनके कम घनत्व15 के कारण खो जाते हैं।
इस संशोधित अलगाव प्रोटोकॉल में, सी 57बीएल /6 चूहों से हेपेटोसाइट्स को क्लासिक दो-चरण कोलेजनेज छिड़काव दृष्टिकोण द्वारा हेपेटेक्टोमी के 24-48 घंटे बाद अलग किया जाता है। आमतौर पर, सेल अलगाव के लिए अवशेष का प्रवेशनी और छिड़काव पोर्टल नस के माध्यम से किया जाता है। हालांकि, प्रमुख शोधन के बाद छोड़े गए छोटे अवशेषों में पोर्टोवस्कुलर प्रतिरोध उच्च16 है, और इस प्रकार छिड़काव नाजुक है। क्योंकि वेना कावा हेपेटेक्टॉमी से अप्रभावित रहता है, इसलिए वेना कावा के प्रवेशनी के माध्यम से प्रतिगामी दिशा में छिड़काव आसानी से किया जा सकता है। एक मानक पेरिस्टालिक पंप कैथेटराइज्ड अवर वेना कावा के माध्यम से गर्म समाधानों को यकृत अवशेष में चलाता है, पोर्टल नस (पूरक चित्रा एस 1) के माध्यम से बहिर्वाह के साथ प्रतिगामी छिड़काव का उपयोग करता है। हेपेटोसाइट्स कोलेजनेस द्वारा अलग होते हैं और ग्लिसन के कैप्सूल से जारी किए जाते हैं। कम गति वाले सेंट्रीफ्यूजेशन दृष्टिकोण का उपयोग करके चरणबद्ध अलगाव द्वारा व्यवहार्य हेपेटोसाइट्स को धोने और सावधानीपूर्वक प्रसंस्करण के बाद, हेपेटोसाइट्स का उपयोग किसी भी डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रकाशित प्रोटोकॉल एफएसीएस सॉर्टिंग के बाद एकल-सेल डाउनस्ट्रीम विश्लेषण या कोशिकाओं के थोक विश्लेषण के लिए सामान्य और स्टीटोटिक मुराइन हेपेटोसाइट्स की उच्च उपज को अलग करने के लिए एक विश्वसनीय और सी?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को स्विस नेशनल फोंड (परियोजना अनुदान 310030_189262) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | – |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | – |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | – |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | – |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | – |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | – |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | – |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | – |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | – |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | – |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | – | – |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | – |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | – |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | – |
| Fenestrated sterile surgical drape | – | – | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | – |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | – |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | – | – |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | – |
| Isofluran station | Provet | – | – |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | – | – |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | – | – |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | – |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | – |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | – | – |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | – | – |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | – |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | – | Adjust to 42 °C |
Referências
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