Isolering af regenererende hepatocytter efter delvis hepatektomi hos mus
Summary
Lipidbelastede hepatocytter er iboende for leverregenerering, men går normalt tabt ved densitetsgradientcentrifugering. Her præsenterer vi en optimeret celleisoleringsprotokol, der bevarer steatotiske hepatocytter, hvilket giver repræsentative populationer af regenererende hepatocytter efter delvis hepatektomi hos mus.
Abstract
Delvis hepatektomi har været meget udbredt til at undersøge leverregenerering hos mus, men isoleringen af høje udbytter af levedygtige hepatocytter til nedstrøms enkeltcelleapplikationer er udfordrende. En markant ophobning af lipider inden for regenererende hepatocytter observeres i løbet af de første 2 dage af normal leverregenerering hos mus. Denne såkaldte forbigående regenereringsassocierede steatose (TRAS) er midlertidig, men overlapper delvist den store proliferative fase. Densitetsgradientrensning er rygraden i de fleste eksisterende protokoller til isolering af primære hepatocytter. Da gradientrensning er afhængig af cellernes tæthed og størrelse, adskiller den ikke-steatotiske fra steatotiske hepatocytpopulationer. Derfor går fede hepatocytter ofte tabt, hvilket giver ikke-repræsentative hepatocytfraktioner.
Den præsenterede protokol beskriver en nem og pålidelig metode til in vivo-isolering af regenererende hepatocytter uanset deres lipidindhold. Hepatocytter fra mandlige C57BL/6-mus isoleres 24-48 timer efter hepatektomi ved en klassisk to-trins kollaganaseperfusionsmetode. En standard peristaltisk pumpe driver de opvarmede opløsninger via det kateteriserede ringere vena cava ind i resten ved hjælp af en retrograd perfusionsteknik med udstrømning gennem portalvenen. Hepatocytter dissocieres af kollagenase for deres frigivelse fra Glissons kapsel. Efter vask og omhyggelig centrifugering kan hepatocytterne anvendes til eventuelle downstream-analyser. Afslutningsvis beskriver dette papir en ligetil og reproducerbar teknik til isolering af en repræsentativ population af regenererende hepatocytter efter delvis hepatektomi hos mus. Metoden kan også hjælpe undersøgelsen af fedtleversygdom.
Introduction
Leveren kan regenerere sig selv selv efter større vævstab. Denne unikke regenerative kapacitet illustreres eksplicit af den eksperimentelle model af delvis (70%) hepatektomi, først beskrevet hos rotter af Higgins og Anderson i 19311. I denne model fjernes 70% af leveren kirurgisk fra dyr ved at klippe større leverlober af. De resterende lapper vokser derefter gennem kompenserende hypertrofi for at genoprette den oprindelige levermasse inden for ca. 1 uge efter operationen, omend uden restaurering af den oprindelige leverarkitektur 2,3. Yderligere hepatektomier med varierende mængder vævsfjernelse er blevet udviklet, såsom 86% forlænget hepatektomi, hvor leverresten er for lille til at komme sig, hvilket i sidste ende fører til posthepatektomi leversvigt (PHLF) og efterfølgende død hos 30% -50% af dyrene 4,5,6. Disse modeller muliggør undersøgelse af normal og mislykket leverregenerering, afhængigt af mængden af resekteret væv (figur 1).
Selvom musemodeller af hepatektomier er blevet brugt med succes i mange år, har først for nylig mere avancerede analysemetoder givet mulighed for en dybere indsigt på enkeltcelleniveau. For de fleste af disse metoder er tilstedeværelsen af individuelle hepatocytter imidlertid en grundlæggende forudsætning. De fleste protokoller til isolering af primære hepatocytter er baseret på en to-trins kollaganaseperfusionsteknik og efterfølgende densitetsgradientrensning for at adskille levedygtige hepatocytter fra affald og ikke-parenkymale såvel som døde celler 7,8,9. Denne metode blev først beskrevet af Berry and Friend i 196910 og tilpasset af Seglen og kolleger i 197211,12. Da gradientcentrifugering imidlertid er afhængig af cellernes tæthed og størrelse, går lipidbelastede hepatocytter ofte tabt under standardrensning. Mens et sådant tab kan være ubetydeligt for mange forskningsspørgsmål, er det et afgørende aspekt for tidlig leverregenerering. I løbet af de første 2 dage akkumulerer hepatocytter i den regenererende muselever lipider og derved vokser i størrelse og dypper i densitet. Denne forbigående regenereringsassocierede steatose (TRAS) tjener til at tilvejebringe regenerativt brændstof og er midlertidig, men overlapper delvist den store proliferative fase og er ujævnt fordelt i leverlobulerne – leverens funktionelle enheder13,14. Efter udvidet 86%-hepatektomi forekommer TRAS imidlertid også, men vedvarer, fordi regenerering er gået i stå, og lipider ikke oxideres14. Derfor vil gradientoprensning af hepatocytter efter 70% eller 86% -hepatektomier give ikke-repræsentative fraktioner, da de fleste lipidbelastede hepatocytter går tabt på grund af deres lave densitet15.
I denne modificerede isolationsprotokol isoleres hepatocytter fra C57BL/6-mus 24-48 timer efter hepatektomi ved en klassisk to-trins kollaganaseperfusionsmetode. Normalt udføres kanylering og perfusion af resten til celleisolering via portalvenen. Imidlertid er portovaskulær resistens i små rester, der er tilbage efter større resektion, høj16, og perfusion er således delikat. Fordi vena cava forbliver upåvirket af hepatektomier, kan perfusion let udføres i retrograd retning via kanylering af vena cava. En standard peristaltisk pumpe driver de opvarmede opløsninger via det kateteriserede inferior vena cava ind i leverresten ved hjælp af retrograd perfusion med udstrømning gennem portalvenen (supplerende figur S1). Hepatocytter dissocieres af collagenaser og frigives fra Glissons kapsel. Efter vask og omhyggelig behandling af levedygtige hepatocytter ved trinvis isolering ved hjælp af en lavhastighedscentrifugeringsmetode kan hepatocytterne anvendes til eventuelle downstream-analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den offentliggjorte protokol giver en pålidelig og ligetil metode til at isolere et højt udbytte af normale og steatotiske murinhepatocytter til enkeltcelle downstream-analyser eller bulkanalyse af celler efter FACS-sortering. Den klare fordel i forhold til densitetsgradientrensning er, at det cellulære lipidindhold i det væsentlige ikke har nogen indflydelse på det effektive udbytte af hepatocytter. Således vil fraktionen af steatotiske hepatocytter blive bevaret og inkluderet i downstream-analyser. Dette er ikke …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af Swiss National Fond (projekttilskud 310030_189262).
Materials
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | – |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | – |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | – |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | – |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | – |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | – |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | – |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | – |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | – |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | – |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | – | – |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | – |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | – |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | – |
| Fenestrated sterile surgical drape | – | – | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | – |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | – |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | – | – |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | – |
| Isofluran station | Provet | – | – |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | – | – |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | – | – |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | – |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | – |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | – | – |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | – | – |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | – |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | – | Adjust to 42 °C |
Referências
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. Partial hepatectomy in mice. Lab Animal. 49, 81-88 (2015).
- Lehmann, K., et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).
- Makino, H., et al. A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice. Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).
- Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N., Gayam, V., Engin, O. . Liver Pathology. , (2019).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Trotter, N. L. A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy. Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).
- Kachaylo, E., et al. PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice. Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Dold, S., et al. Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation. PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).
- Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 5 (22), (2020).
- Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver. Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).
- Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation. Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).
- Roche, . Liberase TM Research Grade. , (2020).
- Giugliano, S., et al. Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication. Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).
- Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes. Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).
- Helling, T. S. Liver failure following partial hepatectomy. HPB. 8 (3), 165-174 (2006).
- Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. Hepatocellular carcinoma and lifestyles. Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).
- Park, W. Y., et al. Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study. Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude. Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- Roeb, E. Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD). Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).
