Erytrocytenbezinkingssnelheid: een door fysica aangedreven karakterisering in een medische context

Summary

Erytrocytenbezinkingssnelheid (ESR) is een fysieke parameter, vaak gebruikt bij routinematige gezondheidscontroles en medische diagnose. Een theoretisch model dat het mogelijk maakt om fysisch zinvolle parameters uit de hele sedimentatiecurve te extraheren, gebaseerd op moderne colloïdale kennis, is onlangs ontwikkeld. Hier presenteren we een protocol om de ESR in de loop van de tijd automatisch te verzamelen en de parameters van dit recente model uit deze geautomatiseerde gegevensverzameling te halen. Deze verfijnde parameters zullen waarschijnlijk ook de medische getuigenis verbeteren.

Abstract

Erytrocyt (of rode bloedcel) sedimentatiesnelheid (ESR) is een fysiek afgeleide parameter van bloed die vaak wordt gebruikt bij routinematige gezondheidscontroles en medische diagnose. In het geval van ontsteking wordt bijvoorbeeld een hogere ESR waargenomen als gevolg van de bijbehorende toename van fibrinogeen en andere plasma-eiwitten. Er werd aangenomen dat deze toename te wijten was aan de vorming van grotere aggregaten van rode bloedcellen (RBC’s) veroorzaakt door de toename van fibrinogeen. Inderdaad, fibrinogeen is een agent-bevorderende aggregatie van RBC’s en in het Stokes-regime – verondersteld te worden waargenomen in bloed-grotere aggregaten sediment sneller. Alle modellen van ESR-metingen op basis van deze hypothese vereisen echter verdere specifieke fysische aannames, die in geen enkel ander systeem vereist zijn. Bovendien hebben moderne studies op het gebied van colloïdale suspensies aangetoond dat aantrekkelijke deeltjes percolerende aggregaten vormen (d.w.z. aggregaten zo breed als de container). De sedimentatie van deze colloïden volgt dan op een zogenaamde “colloïdale gel collapse”. Onlangs is aangetoond dat RBC’s eigenlijk hetzelfde gedrag volgen. Deze hypothese maakt het ook mogelijk om de sedimentatiecurve van RBC’s efficiënt en analytisch te modelleren, waaruit robuuste en fysisch betekenisvolle descriptoren kunnen worden geëxtraheerd. Dit manuscript beschrijft hoe een dergelijke analyse moet worden uitgevoerd en bespreekt de voordelen van deze aanpak.

Introduction

De erytrocytenbezinkingssnelheid (ESR) is een medisch in vitro klinisch hulpmiddel, formeel geïntroduceerd in evidenced-based medicine in de twintigste eeuw 1,2,3,4. Het wordt momenteel wereldwijd gebruikt als een niet-specifieke ontstekingstest, of om de evolutie van sommige specifieke aandoeningen te volgen 5,6,7,8. Dit komt voornamelijk door een toename van de fibrinogeenconcentratie, maar ook in andere plasmacomponenten zoals IgM 1,9,10,11. Volgens het huidige Westergren-standaardprotocol worden ESR-waarden gerapporteerd als de meting van de celvrije plasmalaag op een bepaald tijdstip (30 min of 1 h) na het verlaten van een verticale buis van een typische grootte van 20 cm verticaal in rust¹². Deze meetmethode is echter bekritiseerd omdat kwalitatief verschillende stadia in het sedimentatieproces zijn gemeld, waaronder een vertraging voordat de maximale bezinkingssnelheid¹³ is bereikt. Deze vertraging duurt meer dan 1 uur bij ongeveer de helft van de gezonde monsters¹⁴. De snelheid tijdens deze fase gehoorzaamt aan een andere schaalvergroting dan tijdens de tweede, snellere fase van de sedimentatie¹⁵. Door de uitlezing te beperken tot de gemiddelde bezinkingssnelheid gedurende het eerste uur, wordt vervolgens een verschillende mix van verschillende bloedeigenschappen tussen verschillende individuen vergeleken.

Bovendien is onlangs aangetoond dat de gebruikelijke theoretische overwegingen achter dit protocol onjuist waren^16,17,18. Bij fysiologische hematocriet (boven ongeveer 25%) sedimenteren rode bloedcellen (RBC’s) niet als afzonderlijke aggregaten, maar eerder als een continu, zogenaamd doorsijpelend, netwerk van RBC’s 17,18, gehoorzamend aan een andere set fysische vergelijkingen dan de gewoonlijk genoemde Stokes-sedimentatie ^16,17. Het is aangetoond dat het overwegen van een fysische beschrijving op basis van de tijd-opgeloste metingen van de sedimentatie (hele curve) robuuster was in sommige nieuwe medische contexten^19,20. Bovendien kunnen deze metingen worden gebruikt om licht te werpen op de fysieke mechanismen die de ESR veranderen in pathologieën waarin celvormen worden veranderd^19,20. Bovendien kan een langzame ESR een nuttige medische interpretatie hebben, zoals aangegeven in de metingen van een cohort van patiënten met neuroacanthocytosesyndroom^19,20. Dit artikel bespreekt hoe de meting van fysiek betekenisvolle parameters praktisch kan worden geïmplementeerd, op basis van de hele ESR-kinetiek. Nauwkeuriger gezegd, de hier gepresenteerde methode extraheert de maximale sedimentatiesnelheid U_m, waarvan de waarde kan worden gecorrigeerd om rekening te houden met het effect van de hematocriet van de donor^16,17. Deze parameter is nauwkeuriger en dus betrouwbaarder dan de traditionele meting^16,17,19,20.

Bovendien is het in sommige fundamentele onderzoeken, in plaats van de ontstekingstoestand van een bepaalde patiënt te monitoren, interessant om het effect van hematocriet op de ESR 21,22,23 uit te sluiten, of om de rol van RBC’s in een gemodificeerde ESR 19,20,24,25 te onderzoeken tussen verschillende donoren. Het kan nuttig zijn om monsters te vergelijken die niet direct volbloedmonsters van patiënten zijn. Daarom kan het resuspendiëren van RBC’s met een gecontroleerde hematocriet in het autologe plasma of in een plasmasubstituent worden gebruikt als de eerste stap van ESR-meting. Oplossingen van Dextran 70 kDa met een concentratie van 55 mg/ml in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) produceren bijvoorbeeld een sedimentatiebereik binnen het controlebereik voor gezonde cellen¹⁹. Dit manuscript laat ook zien hoe dergelijke stappen moeten worden uitgevoerd en dat de gepresenteerde analyse ook in deze gevallen relevant is.

Protocol

Bloedafname en experimenten werden goedgekeurd door de “Ärztekammer des Saarlandes”, ethiek votum 51/18, en uitgevoerd na geïnformeerde toestemming was verkregen volgens de Verklaring van Helsinki. Standaardmetingen moeten worden uitgevoerd met ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-antistollingsbloed (standaard EDTA-concentratie van 1,6 mg/ml bloed, Europese norm NF EN ISO 6710), in Westergren-buizen. Het volume dat nodig is om de Westergren-buis te vullen, is afhankelijk van de fabrikant (omdat lagere delen soms een b…

Representative Results

Een voorbeeld van een correct verkregen beeldreeks wordt gegeven als Aanvullende film 1 (MovieS1.avi). Een reeks karakteristieke pasvormen van het model is weergegeven voor verschillende omstandigheden in figuur 2. De fibrinogeenconcentratie werd bepaald aan de hand van de fibrinogeenconcentratie in het plasma Fib0, ervan uitgaande dat het serum helemaal geen fibrinogeen bevat. Vandaar dat Fib = C Fib0, waarbij C de plasmavolu…

Discussion

Om het geautomatiseerde protocol efficiënt te laten werken, is het belangrijk om een duidelijke achtergrond en de juiste verlichting te hebben. Een donkere achtergrond kan het bestaan van een efficiënte binarisatiedrempel voorkomen. Voor monsters met enige hemolyse, die meestal optreedt (toeneemt) in de loop van de tijd, is het belangrijk om eerst te verifiëren of de gekozen binarisatiedrempel relevant is voor zowel de eerste als de uiteindelijke foto’s.

Als het gaat om het binarisatieproce…

Materials

Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample)	SARSTEDT	267001 or 265	Anticoagulated blood sample to characterize
Camera EOS M50	Canon	Kit EF-M18-150 IS STM	Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available
Centrifuge	HERMLE	302.00 V03 – Z 36 HK	Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min.
Micro-centrifuge	MLW	TH21	or any other way to determine the hematocrit
Micro-hematocrit capilaries	Fisher scientific	11884040	or other capillaries/containers for hematocrit determination
Phosphate Buffered Saline (PBS)	ThermoFisher	10010023	1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipettes (e.g. positive displacement pipette)	Gilson	FD10006	Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids.
Wax sealing plate	Hirschmann	9120101	Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries
Westergren tubes	Praxindo	A9244560	Any other standard Wetsergren tube should work too
White background with illumination	/	/	White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient.