Apresentamos aqui um protocolo para cultivo de células IDG-SW3 em uma matriz extracelular tridimensional (3D).
Os osteócitos são considerados células não proliferativas que se diferenciam terminalmente dos osteoblastos. Osteoblastos embutidos na matriz extracelular óssea (osteóide) expressam o gene Pdpn para formar dendritos celulares e transformar-se em preosteócitos. Posteriormente, os pré-osteócitos expressam o gene Dmp1 para promover a mineralização da matriz e, assim, transformar-se em osteócitos maduros. Esse processo é chamado de osteocitogênese. IDG-SW3 é uma linhagem celular bem conhecida para estudos in vitro de osteocitogênese. Muitos métodos anteriores utilizaram o colágeno I como principal ou único componente da matriz de cultivo. No entanto, além do colágeno I, o osteóide também contém uma substância fundamental, que é um componente importante na promoção do crescimento, adesão e migração celular. Além disso, a substância da matriz é transparente, o que aumenta a transparência do gel formado pelo colágeno I e, assim, auxilia a exploração da formação de dendritos por meio de técnicas de imagem. Assim, este trabalho detalha um protocolo para estabelecer um gel 3D usando uma matriz extracelular juntamente com colágeno I para a sobrevivência do IDG-SW3. Neste trabalho, a formação de dendritos e a expressão gênica foram analisadas durante a osteocitogênese. Após 7 dias de cultura osteogênica, uma extensa rede dendrítica foi claramente observada sob microscópio confocal de fluorescência. A PCR em tempo real mostrou que os níveis de RNAm de Pdpn e Dmp1 aumentaram continuamente por 3 semanas. Na semana 4, o estereomicroscópio revelou um gel opaco preenchido com partículas minerais, consistente com o ensaio de fluorescência de raios X (XRF). Estes resultados indicam que esta matriz de cultura facilita com sucesso a transição de osteoblastos para osteócitos maduros.
Os osteócitos são células terminalmente diferenciadas derivadas dososteoblastos1,2. Uma vez sepultado pelo osteóide, o osteoblasto sofre osteocitogênese e expressa o gene Pdpn para formar preosteócitos, o gene Dmp1 para mineralizar o osteóide e os genes Sost e Fgf23 para funcionar como osteócito maduro no tecido ósseo3. Aqui, um sistema de cultura 3D é introduzido para identificar a extensão dos dendritos e a expressão gênica de marcadores no processo de osteocitogênese.
As células IDG-SW3 são uma linhagem celular primária imortalizada derivada de camundongos transgênicos e podem expandir ou replicar osteoblastos para diferenciação tardia de osteócitos quando cultivadas em diferentesmeios4. Em comparação com MLO-A5, MLO-Y4 e outras linhagens celulares, o perfil de expressão de proteínas funcionais, a capacidade de realizar deposição de sal de cálcio e as respostas a vários hormônios em células IDG-SW3 são mais prováveis de serem as mesmas que as de osteócitos primários no tecidoósseo4.
Comparados aos sistemas 2D, os sistemas de cultivo 3D são mais capazes de mimetizar o ambiente de crescimento celular in vivo, incluindo o gradiente de nutrientes, baixa rigidez mecânica e faixa mecânica circundante (Tabela 1). A maioria dos métodos anteriores de cultivo de células osteoblásticas em sistema 3D utilizava o colágeno I como único componente nas formulações 4,5,6, pois as fibras colágenas I servem como local de deposição de cálcio e fósforo. Entretanto, um constituinte indispensável no osteóide, a matriz extracelular, contém um grande grupo de fatores celulares que promovem o crescimento, adesão e migraçãocelular7,8 e é transparente e conveniente para a observação por imagem. Assim, este protocolo utiliza o Matrigel (doravante denominado matriz de membrana basal) como componente secundário para o estudo da osteocitogênese.
Um ponto crítico nesse protocolo é que as etapas 1 e 2 devem ser realizadas em gelo para evitar coagulação espontânea. Nesse método, a concentração final de colágeno I foi de 1,2 mg/mL. Assim, um volume ótimo de ddH2O deve ser calculado para corresponder aos diferentes colágenos de vários fabricantes.
In vivo, a osteocitogênese envolve um movimento polar de osteoblastos da superfície para o interior do osso trabecular14. Este protocolo …
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos à Dra. Lynda F. Bonewald por presentear a linhagem celular IDG-SW3. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82070902, 82100935 e 81700778) e pelo Projeto de Vela “Ciência e Inovação Tecnológica” de Xangai (21YF1442000).
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |