Cultivo de Células IDG-SW3 em Matriz Tridimensional Extracelular

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo para cultivo de células IDG-SW3 em uma matriz extracelular tridimensional (3D).

Resumo

Os osteócitos são considerados células não proliferativas que se diferenciam terminalmente dos osteoblastos. Osteoblastos embutidos na matriz extracelular óssea (osteóide) expressam o gene Pdpn para formar dendritos celulares e transformar-se em preosteócitos. Posteriormente, os pré-osteócitos expressam o gene Dmp1 para promover a mineralização da matriz e, assim, transformar-se em osteócitos maduros. Esse processo é chamado de osteocitogênese. IDG-SW3 é uma linhagem celular bem conhecida para estudos in vitro de osteocitogênese. Muitos métodos anteriores utilizaram o colágeno I como principal ou único componente da matriz de cultivo. No entanto, além do colágeno I, o osteóide também contém uma substância fundamental, que é um componente importante na promoção do crescimento, adesão e migração celular. Além disso, a substância da matriz é transparente, o que aumenta a transparência do gel formado pelo colágeno I e, assim, auxilia a exploração da formação de dendritos por meio de técnicas de imagem. Assim, este trabalho detalha um protocolo para estabelecer um gel 3D usando uma matriz extracelular juntamente com colágeno I para a sobrevivência do IDG-SW3. Neste trabalho, a formação de dendritos e a expressão gênica foram analisadas durante a osteocitogênese. Após 7 dias de cultura osteogênica, uma extensa rede dendrítica foi claramente observada sob microscópio confocal de fluorescência. A PCR em tempo real mostrou que os níveis de RNAm de Pdpn e Dmp1 aumentaram continuamente por 3 semanas. Na semana 4, o estereomicroscópio revelou um gel opaco preenchido com partículas minerais, consistente com o ensaio de fluorescência de raios X (XRF). Estes resultados indicam que esta matriz de cultura facilita com sucesso a transição de osteoblastos para osteócitos maduros.

Introdução

Os osteócitos são células terminalmente diferenciadas derivadas dos^{osteoblastos1,2}. Uma vez sepultado pelo osteóide, o osteoblasto sofre osteocitogênese e expressa o gene Pdpn para formar preosteócitos, o gene Dmp1 para ^{mineralizar o osteóide e os} genes Sost e Fgf23 para funcionar como osteócito maduro no tecido ósseo3. Aqui, um sistema de cultura 3D é introduzido para identificar a extensão dos dendritos e a expressão gênica de marcadores no processo de osteocitogênese.

As células IDG-SW3 são uma linhagem celul....

Protocolo

Este protocolo é adequado para o cultivo de células em quatro poços de placas de 24 poços. Se preparar várias amostras ou placas, as quantidades dos reagentes devem ser aumentadas em conformidade.

1. Preparação da mistura de colágeno I

NOTA: Colágeno I e gel de matriz de membrana basal rapidamente à temperatura ambiente. Portanto, o colágeno deve ser manipulado no gelo (2 °C a 8 °C). Todas as pontas e tubos utilizados devem ser pré-refrigerados, salvo indicação em contrário. Todos os procedimentos devem ser realizados em uma capa de segurança.

1. Coloque todos os reagentes e tubos de centr....

Resultados

Após a coloração de células vivas/mortas, as células foram visualizadas em microscópio confocal a laser. Todas as células eram positivas para calceína AM (cor verde) e quase não havia células positivas para EthD-1 (cor vermelha) no campo, indicando que o sistema de gel feito por este método é altamente adequado para osteocitogênese (Figura 1A, esquerda). Para melhor determinar a distribuição espacial das células, uma imagem pseudocolorida foi escolhida para exibir os dendritos celulares em d.......

Discussão

Um ponto crítico nesse protocolo é que as etapas 1 e 2 devem ser realizadas em gelo para evitar coagulação espontânea. Nesse método, a concentração final de colágeno I foi de 1,2 mg/mL. Assim, um volume ótimo de ddH₂O deve ser calculado para corresponder aos diferentes colágenos de vários fabricantes.

In vivo, a osteocitogênese envolve um movimento polar de osteoblastos da superfície para o interior do osso trabecular14. Este protocolo libera as célu.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% Ácido tripsina-etilenodiaminotetracético	Hyclone	SH30042.01
Tubos de 15 mL	Corning, NY, EUA	430791
7,5% (p/v) Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich, MO, EUA	S8761
	Sigma-Aldrich, MO, EUA	A4544
Colágeno I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
soro fetal bovino	Thermo Fisher Scientific	10099141
homogeneizador	BiHeng  Biotecnologia, Xangai, China	Microscopia
	Carl  Zeiss, Oberkochen, Alemanha	LSM 800
Kit de imagem de células vivas/mortas	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matriz matrigel	Corning, NY, EUA	356234
MEM (10X), sem glutamina	Thermo Fisher Scientific	21430079
paraformaldeído	Sigma-Aldrich, MO, EUA	158127
solução salina tamponada com fosfato	Hyclone	SH30256.
Microscópio estéreo	Carl  Zeiss, Oberkochen, Alemanha	Zeiss Axio ZOOM. V16
	Trizol Thermo Fisher Scientific	15596026
fluorescência de raios X	EDAX, EUA	EAGLE III&
BETA;-GLICEROFOSFATO	Sigma-Aldrich, MO, EUA	G9422

Ácido ascórbico de fluorescência confocal a laser SKSI FS