Skalerbar, fleksibel og omkostningseffektiv podning af frøplanter
Summary
Denne protokol beskriver en robust podningsmetode til frøplanter, der ikke kræver nogen forudgående erfaring eller træning og kan udføres til en meget lav pris ved hjælp af materialer, der er let tilgængelige i de fleste molekylærbiologiske laboratorier.
Abstract
Tidlig fase podning af frøplanter er blevet et populært værktøj inden for molekylær genetik til at studere rodskudsforhold inden for planter. Podning af tidlige frøplanter fra den lille modelplante, Arabidopsis thaliana, er teknisk udfordrende og tidskrævende på grund af plantens størrelse og skrøbelighed. En voksende samling af offentliggjorte metoder beskriver denne teknik med varierende succesrater, vanskeligheder og tilknyttede omkostninger. Dette papir beskriver en simpel procedure til fremstilling af en intern genanvendelig podningsanordning ved hjælp af silikoneelastomerblanding, og hvordan man bruger denne enhed til podning af frøplanter. På tidspunktet for denne publikation koster hver genanvendelig podningsenhed kun $ 0.47 i forbrugsmaterialer at producere. Ved hjælp af denne metode kan begyndere få deres første vellykkede podede frøplanter på mindre end 3 uger fra start til slut. Denne meget tilgængelige procedure vil gøre det muligt for plantemolekylærgenetiske laboratorier at etablere podning af frøplanter som en normal del af deres eksperimentelle proces. På grund af den fulde kontrol, brugerne har i oprettelsen og designet af disse podningsanordninger, kan denne teknik let justeres til brug i større planter, såsom tomat eller tobak, hvis det ønskes.
Introduction
Podning er en gammel havebrugsteknik, der blev en etableret landbrugspraksis i 500 fvt1. Podning af forskellige sorter af afgrødeplanter for at forbedre udbyttet var den første anvendelse af denne teknik og bruges fortsat til dette formål i dag. I det sidste årti har podning tiltrukket sig en stigende mængde opmærksomhed som et værktøj for molekylærbiologer til at studere langdistancesignalering i planter 2,3,4,5. Mens podning af voksne planter er relativt let, er podning af planter kort efter spiring udfordrende. På trods af dette er det undertiden nødvendigt at vurdere virkningerne af langdistancesignalering i processer som planteudvikling, miljøresponser og blomstring 6,7,8.
Arabidopsis thaliana er blevet etableret som modelorganismen i plantebiologi af mange grunde, herunder dens relativt lille størrelse, hvilket gør den let at dyrke inde i et laboratorium. Den lille størrelse og skrøbelighed af Arabidopsis-frøplanter gør imidlertid podning af unge frøplanter meget udfordrende. I mange tilfælde kræves omfattende praktisk træning for at opnå frøplantetransplantater. Der har været mange metodologiske forbedringer gennem årene, der har identificeret ideelle vækstbetingelser og nye teknikker til at øge succesraten for podning af frøplanter 9,10,11. Det seneste værktøj, der blev introduceret, var en Arabidopsis-podningschip, der gør det muligt for selv uerfarne brugere at opnå acceptable niveauer af podningssucces12. Mens dette fremskridt har sænket den tekniske barriere for podning af frøplanter betydeligt, er chipenheden dyr, og antallet af transplantater, der kan udføres parallelt, bliver hurtigt uoverkommeligt.
Derudover kan denne enhed kun bruges til Arabidopsis-frøplanter, der har hypocotyldimensioner, der ligner vildtypeplanter. Mens Arabidopsis er nøglestensarten i verden af plantemolekylær genetik, er der for nylig udført arbejde i andre arter ved hjælp af podning af frøplanter. Eksempler inkluderer podning af sojabønner og den almindelige bønne, tobak til tomat og raps til Arabidopsis, og efterfølgende prøveudtagning af begge væv til små RNA’er13,14. Derfor er en podningsmetode, der er tilgængelig for de fleste laboratorier og let kan tilpasses en lang række plantearter uden større tekniske ændringer, meget ønskelig.
Denne protokol beskriver en metode, der anvender intern produktion af en simpel podningsenhed, der giver mulighed for fuld tilpasning af podningskanalens diameter og længde for at imødekomme enhver frøplantemorfologi på tværs af de fleste plantearter. Produktionen af disse enheder er meget overkommelig og meget skalerbar, da de eneste nødvendige komponenter er silikoneelastomer, ledninger eller slanger i den korrekte størrelse, et højpræcisionsblad og en beholder til at fungere som form. Efter podningsprotokollen, der er beskrevet her, kan brugerne opnå vellykkede podningshastigheder på 45% (n = 105), sammenlignelig med tidligere rapporterede podningsresultater10,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Resumé og betydning
Dannelse af en transplantatforening er afgørende for vellykket podning, hvilket kræver direkte og uforstyrret kontakt mellem grundstammen og scion. Ministørrelsen og skrøbeligheden af frøplanter af små planter som Arabidopsis gør det teknisk udfordrende at opfylde dette krav. En teknik udviklet i tidlige Arabidopsis-frøplantepodningsmetoder var at indsætte både scion og grundstammen i en kort silikone slangekrave for at understøtte transplantatkrydset<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tak til Javier Brumos for indledende træning og vejledning i podning af Arabidopsis-frøplanter .
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
Referências
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. A history of grafting. Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y. Shoot-root communication in flowering plants. Current Biology. 27 (17), 973-978 (2017).
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -. J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
