Innesto di piantine scalabile, flessibile ed economico
Summary
Questo protocollo descrive un robusto metodo di innesto di piantine che non richiede alcuna esperienza o formazione precedente e può essere eseguito a un costo molto basso utilizzando materiali facilmente accessibili nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare.
Abstract
L’innesto di piantine in fase iniziale è diventato uno strumento popolare nella genetica molecolare per studiare le relazioni radice-germoglio all’interno delle piante. L’innesto di piantine in fase iniziale della piccola pianta modello, Arabidopsis thaliana, è tecnicamente impegnativo e richiede tempo a causa delle dimensioni e della fragilità delle sue piantine. Una crescente raccolta di metodi pubblicati descrive questa tecnica con diversi tassi di successo, difficoltà e costi associati. Questo documento descrive una semplice procedura per realizzare un dispositivo di innesto riutilizzabile internamente utilizzando una miscela di elastomero siliconico e come utilizzare questo dispositivo per l’innesto di piantine. Al momento di questa pubblicazione, ogni dispositivo di innesto riutilizzabile costa solo $ 0,47 in materiali di consumo da produrre. Utilizzando questo metodo, i principianti possono avere le loro prime piantine innestate con successo in meno di 3 settimane dall’inizio alla fine. Questa procedura altamente accessibile consentirà ai laboratori di genetica molecolare vegetale di stabilire l’innesto di piantine come parte normale del loro processo sperimentale. A causa del pieno controllo che gli utenti hanno nella creazione e nella progettazione di questi dispositivi di innesto, questa tecnica potrebbe essere facilmente adattata per l’uso in piante più grandi, come il pomodoro o il tabacco, se lo si desidera.
Introduction
L’innesto è un’antica tecnica orticola che divenne una pratica agricola consolidata dal 500 aC1. L’innesto di diverse varietà di piante coltivate per migliorare le rese è stato il primo uso di questa tecnica e continua ad essere utilizzato per questo scopo oggi. Nell’ultimo decennio, l’innesto ha attirato una crescente attenzione come strumento per i biologi molecolari per studiare la segnalazione a lunga distanza nelle piante 2,3,4,5. Mentre l’innesto di piante adulte è relativamente facile, l’innesto di piante subito dopo la germinazione è impegnativo. Nonostante ciò, a volte è necessario valutare gli effetti della segnalazione a lunga distanza in processi come lo sviluppo delle piante, le risposte ambientali e la fioritura 6,7,8.
Arabidopsis thaliana è stato stabilito come l’organismo modello nella biologia vegetale per molte ragioni, tra cui le sue dimensioni relativamente piccole, che lo rendono facile da coltivare all’interno di un laboratorio. Tuttavia, le piccole dimensioni e la fragilità delle piantine di Arabidopsis rendono l’innesto di giovani piantine molto impegnativo. In molti casi, è necessaria un’ampia formazione pratica per ottenere con successo gli innesti di piantina. Ci sono stati molti miglioramenti metodologici nel corso degli anni che hanno identificato condizioni di crescita ideali e nuove tecniche per aumentare il tasso di successo dell’innesto di piantine 9,10,11. Lo strumento più recente introdotto è stato un chip di innesto di piantine di Arabidopsis, che consente anche agli utenti inesperti di raggiungere livelli accettabili di successo dell’innesto12. Mentre questo progresso ha abbassato significativamente la barriera tecnica dell’innesto di piantine, il dispositivo chip è costoso e il numero di innesti che possono essere condotti in parallelo diventa rapidamente proibitivo dal punto di vista dei costi.
Inoltre, questo dispositivo può essere utilizzato solo per piantine di Arabidopsis che hanno dimensioni ipocotiliche simili alle piantine selvatiche. Mentre Arabidopsis è la specie chiave nel mondo della genetica molecolare vegetale, recentemente è stato fatto un lavoro in altre specie utilizzando l’innesto di piantine. Gli esempi includono l’innesto di soia e fagiolo comune, tabacco a pomodoro e colza a Arabidopsis, e successivamente il campionamento di entrambi i tessuti per piccoli RNA13,14. Pertanto, è altamente auspicabile un metodo di innesto accessibile alla maggior parte dei laboratori e facilmente adattabile a una vasta gamma di specie vegetali senza grandi cambiamenti tecnici.
Questo protocollo descrive un metodo che impiega la produzione interna di un semplice dispositivo di innesto che consente la completa personalizzazione del diametro e della lunghezza del canale di innesto per adattarsi a qualsiasi morfologia della piantina nella maggior parte delle specie vegetali. La produzione di questi dispositivi è molto economica e altamente scalabile, in quanto gli unici componenti necessari sono elastomero siliconico, cablaggio o tubo delle dimensioni corrette, una lama ad alta precisione e un contenitore che funge da stampo. Seguendo il protocollo di innesto descritto qui, gli utenti possono ottenere tassi di innesto di successo del 45% (n = 105), paragonabili ai risultati dell’innesto precedentemente riportati10,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Riassunto e significato
La formazione di un’unione di innesto è fondamentale per un innesto di successo, che richiede un contatto diretto e indisturbato tra il portinnesto e il rampollo. Le dimensioni in miniatura e la fragilità delle piantine di piccole piante come Arabidopsis rendono tecnicamente difficile soddisfare questo requisito. Una tecnica sviluppata nei primi metodi di innesto della piantina di Arabidopsis era quella di inserire sia il rampollo che il portainnesto in un c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grazie a Javier Brumos per la formazione iniziale e la guida nell’innesto di piantine di Arabidopsis .
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
Referências
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