Skalerbar, fleksibel og kostnadseffektiv poding av frøplanter
Summary
Denne protokollen beskriver en robust plantepodemetode som ikke krever tidligere erfaring eller opplæring, og kan utføres til en svært lav pris ved bruk av materialer som er lett tilgjengelige i de fleste molekylærbiologiske laboratorier.
Abstract
Transplantasjon av frøplanter på et tidlig stadium har blitt et populært verktøy innen molekylær genetikk for å studere rotskuddforhold i planter. Poding av frøplanter i tidlig fase av den lille modellplanten, Arabidopsis thaliana, er teknisk utfordrende og tidkrevende på grunn av plantenes størrelse og skjørhet. En voksende samling av publiserte metoder beskriver denne teknikken med varierende suksessrate, vanskelighetsgrad og tilhørende kostnader. Dette papiret beskriver en enkel prosedyre for å lage en intern gjenbrukbar podeenhet ved hjelp av silikonelastomerblanding, og hvordan du bruker denne enheten til frøplantepodning. På tidspunktet for denne publikasjonen koster hver gjenbrukbar podeenhet bare $ 0.47 i forbruksmateriell å produsere. Ved hjelp av denne metoden kan nybegynnere få sine første vellykkede podede frøplanter på mindre enn 3 uker fra start til slutt. Denne svært tilgjengelige prosedyren vil tillate laboratorier for plantemolekylærgenetikk å etablere plantetransplantasjon som en normal del av deres eksperimentelle prosess. På grunn av den fulle kontrollen brukerne har i opprettelsen og utformingen av disse podeenhetene, kan denne teknikken enkelt justeres for bruk i større planter, for eksempel tomat eller tobakk, om ønskelig.
Introduction
Poding er en gammel hagebruksteknikk som ble en etablert landbrukspraksis ved 500 fvt1. Poding av forskjellige varianter av planteplanter for å forbedre utbyttet var den første bruken av denne teknikken, og fortsetter å bli brukt til dette formålet i dag. I det siste tiåret har poding tiltrukket seg en økende mengde oppmerksomhet som et verktøy for molekylærbiologer for å studere langdistansesignalering i planter 2,3,4,5. Selv om poding av voksne planter er relativt enkelt, er poding av planter kort tid etter spiring utfordrende. Til tross for dette er det noen ganger nødvendig å vurdere effekten av langdistansesignalering i prosesser som planteutvikling, miljøresponser og blomstring 6,7,8.
Arabidopsis thaliana har blitt etablert som modellorganismen i plantebiologi av mange grunner, inkludert den relativt små størrelsen, noe som gjør det enkelt å dyrke inne i et laboratorium. Den lille størrelsen og skjøtheten til Arabidopsis-frøplanter gjør imidlertid podning av unge frøplanter svært utfordrende. I mange tilfeller er det nødvendig med omfattende praktisk opplæring for å lykkes med å skaffe frøplantetransplantater. Det har vært mange metodiske forbedringer gjennom årene som har identifisert ideelle vekstforhold og nye teknikker for å øke suksessraten for frøplantepoding 9,10,11. Det siste verktøyet som ble introdusert var en Arabidopsis frøplantepodebrikke, som gjør det mulig for selv uerfarne brukere å oppnå akseptable nivåer av podesuksess12. Selv om dette fremskrittet har senket den tekniske barrieren for frøplantetransplantasjon betydelig, er chipenheten dyr, og antall transplantater som kan utføres parallelt blir raskt kostnadsforbudende.
I tillegg kan denne enheten bare brukes til Arabidopsis-frøplanter som har hypokotyldimensjoner som ligner på frøplanter av villtype. Mens Arabidopsis er keystone-arten i verden av plantemolekylær genetikk, har nyere arbeid blitt gjort i andre arter ved hjelp av frøplantepoding. Eksempler er poding av soyabønner og vanlig bønne, tobakk til tomat og raps til Arabidopsis, og deretter prøvetaking av begge vev for små RNA13,14. Derfor er en podemetode som er tilgjengelig for de fleste laboratorier og enkelt kan tilpasses et bredt spekter av plantearter uten store tekniske endringer, svært ønskelig.
Denne protokollen beskriver en metode som benytter intern produksjon av en enkel podeinnretning som muliggjør full tilpasning av podekanaldiameter og lengde for å imøtekomme enhver frøplantemorfologi på tvers av de fleste plantearter. Produksjonen av disse enhetene er svært rimelig og svært skalerbar, da de eneste komponentene som trengs er silikonelastomer, ledninger eller rør av riktig størrelse, et høypresisjonsblad og en beholder for å tjene som en form. Ved å følge podeprotokollen som er beskrevet her, kan brukerne oppnå vellykkede transplantasjonsrater på 45 % (n = 105), sammenlignbare med tidligere rapporterte poderesultater10,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oppsummering og betydning
Dannelse av en graftforening er avgjørende for vellykket poding, noe som krever direkte og uforstyrret kontakt mellom grunnstammen og scion. Miniatyrstørrelsen og skjøtheten til frøplanter av små planter som Arabidopsis gjør det teknisk utfordrende å oppfylle dette kravet. En teknikk utviklet i tidlige Arabidopsis frøplantetransplantasjonsmetoder var å sette inn både scion og grunnstammen i en kort silikonrørkrage for å støtte graftkrysset<sup c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Takk til Javier Brumos for innledende opplæring og veiledning i poding av Arabidopsis-frøplanter .
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR International Inc | 10026-076 | |
| ACETONE (HPLC & ACS Certified Solvent) 4 L | VWR | BJAH010-4 | |
| BactoAgar | Sigma | A1296-500g | |
| Dow SYLGARD 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Dow | 2646340 | |
| D-Sucrose (Molecular Biology), 1 kg | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Flex-Tube Tubes (1.5 mL), pack of 500 | Fisher Scientific | 20901-551 / 05-402 | |
| Fisherbrand High Precision #4 Style Scalpel Handle | Fisher Scientific | 12-000-164 | |
| Fisherbrand Lead-Free Autoclave Tape | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| Fisherbrand square petri dishes | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Leica Zoom 2000 Stereo Microscope | Microscope Central | L-Z2000 | |
| Micropore Tape | 3M | B0082A9FEM | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519-10L | |
| Parafilm | Genesee Scientific | 16-101 | |
| potassium hydroxide | VWR International Inc | AA13451-36 | |
| Redi-earth Plug and Seedling Mix | Sun Gro Horticulture | SUN239274728CFLP | |
| Scotts Osmocote Plus | Hummert International | 7630600 | |
| Surgical Design No. 22 Carbon Scalpel Blade | Fisher Scientific | 22-079-697 | |
| Tween 20, 500 mL | Fisher Scientific | BP337500 | |
| TWEEZER DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM | VWR | 102091-580 |
Referências
- Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. A history of grafting. Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).
- Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying. Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).
- Notaguchi, M., Okamoto, S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, 161 (2015).
- Ko, D., Helariutta, Y. Shoot-root communication in flowering plants. Current Biology. 27 (17), 973-978 (2017).
- Thomas, H. R., Frank, M. H. Connecting the pieces: uncovering the molecular basis for long-distance communication through plant grafting. New Phytologist. 223 (2), 582-589 (2019).
- Takahashi, F., et al. A small peptide modulates stomatal control via abscisic acid in long-distance signalling. Nature. 556 (7700), 235-238 (2018).
- Brumos, J., et al. Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development. Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).
- Corbesier, L., et al. FT protein movement contributes to long-distance signaling in floral induction of Arabidopsis. Science. 316 (5827), 1030-1033 (2007).
- Yin, H., et al. Graft-union development: A delicate process that involves cell-cell communication between scion and stock for local auxin accumulation. Journal of Experimental Botany. 63 (11), 4219-4232 (2012).
- Turnbull, C. G. N., Booker, J. P., Leyser, H. M. O. Micrografting techniques for testing long-distance signalling. The Plant Journal. 32 (2), 255-262 (2002).
- Marsch-Martínez, N., et al. An efficient flat-surface collar-free grafting method for Arabidopsis thaliana seedlings. Plant Methods. 9 (1), 14 (2013).
- Tsutsui, H., et al. Micrografting device for testing systemic signaling in Arabidopsis. The Plant Journal. 103 (2), 918-929 (2020).
- Xia, C., et al. Elucidation of the mechanisms of long-distance mRNA movement in a Nicotiana benthamiana/tomato heterograft system. Plant Physiology. 177 (2), 745-758 (2018).
- Li, S., et al. Unidirectional movement of small RNAs from shoots to roots in interspecific heterografts. Nature Plants. 7 (1), 50-59 (2021).
- Ragni, L., Hardtke, C. S. Small but thick enough-the Arabidopsis hypocotyl as a model to study secondary growth. Physiologia Plantarum. 151 (2), 164-171 (2014).
- Chen, I. -. J., et al. A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings. Plant Science. 209, 46-57 (2013).
- An, F., et al. Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings. Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).
- Vandenbussche, F., et al. Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins. Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).
- Vandenbussche, F., et al. The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin. Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).
- Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls. Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).
