Analisi morfologica e composizionale di trappole extracellulari neutrofile indotte da stimoli microbici e chimici

Summary

Presentato qui è un protocollo per l’induzione e l’analisi di trappole extracellulari (NET) di neutrofili in vitro . La quantificazione del DNA, della catelicidina (LL37) e dell’attività enzimatica ha prodotto dati che mostrano la variabilità nella composizione e morfologia dei NET indotta da stimoli microbici e chimici in condizioni controllate simili.

Abstract

I neutrofili funzionano come la prima linea di difesa cellulare in una risposta immunitaria innata impiegando diversi meccanismi, come la formazione di trappole extracellulari per neutrofili (NET). Questo studio analizza i cambiamenti morfologici e composizionali nei NET indotti da stimoli microbici e chimici utilizzando metodologie standardizzate in vitro per l’induzione e la caratterizzazione del NET con cellule umane. Le procedure qui descritte consentono l’analisi della morfologia NET (litica o non litica) e della composizione (strutture DNA-proteina e attività enzimatica), e l’effetto di fattori solubili o di contatto cellulare su tali caratteristiche. Inoltre, le tecniche qui descritte potrebbero essere modificate per valutare l’effetto di fattori solubili esogeni o del contatto cellulare sulla composizione NET.

Le tecniche applicate includono la purificazione di cellule polimorfonucleate dal sangue periferico umano utilizzando un gradiente a doppia densità (1,079-1,098 g/ml), garantendo purezza e vitalità ottimali (≥ 95%) come dimostrato dalla colorazione di Wright, dall’esclusione del blu di tripano e dalla citometria a flusso, compresa l’analisi FSC versus SSC e la colorazione 7AAD. La formazione di NET è indotta da stimoli microbici (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida albicans) e chimici (phorbol myristate acetate, HOCl) e i NET sono caratterizzati da colorazione DNA-DAPI, immunocolorazione per il peptide antimicrobico catelicidina (LL37) e quantificazione dell’attività enzimatica (elastasi neutrofila, catepsina G e mieloperossidasi). Le immagini vengono acquisite al microscopio a fluorescenza e analizzate con ImageJ.

Introduction

I neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel flusso sanguigno, svolgendo un ruolo essenziale durante la clearance degli agenti patogeni attraverso diversi meccanismi, tra cui il rilascio di grandi strutture cromatiniche composte da DNA e diverse proteine antibatteriche nucleari, citoplasmatiche e granulari ^1,2. L’antecedente diretto che descrive questo ruolo antimicrobico dei neutrofili è stato fatto da Takei et ^al.3 nel 1996. Questi autori hanno riportato una nuova forma di morte diversa dall’apoptosi e dalla necroptosi nei neutrofili, hanno mostrato cambiamenti morfologici che mostrano rottura nucleare, seguita da fuoriuscita dal nucleoplasma nel citoplasma e un aumento della permeabilità della membrana da 3 ore di incubazione con forbolo miristato acetato (PMA)^2,3. Tuttavia, non è stato fino al 2004 che è stato utilizzato il termine “trappole extracellulari di neutrofili (NET)”⁴.

La formazione di NET è stata osservata in varie condizioni, come infezioni batteriche, fungine⁵, virali⁶ e parassitarie, per neutralizzare, uccidere e prevenire la diffusione microbica⁷. Altri studi dimostrano che può verificarsi anche in condizioni non patogene da stimoli sterili, come citochine, acido urico monosodico o cristalli di colesterolo, autoanticorpi, immunocomplessi e piastrine attivate⁷. Il lipopolisaccaride (LPS), l’interleuchina-8 (IL-8) e la PMA sono stati tra i primi stimoli in vitro descritti come induttori NET e il coinvolgimento in vivo del NET nei processi patogeni è stato dimostrato de due modelli di infiammazione acuta: dissenteria sperimentale e appendicite umana spontanea⁴. Il DNA è un componente essenziale di NET. La sua struttura e composizione appropriate sono necessarie per il sequestro e l’uccisione dei microrganismi fornendo un’alta concentrazione locale di molecole antimicrobiche verso i microbi catturati, come dimostrato da un breve trattamento con desossiribonucleasi (DNasi) che disintegra i NET e le loro proprietà microbicide⁴. Oltre al DNA, i NET comprendono proteine attaccate come istoni, elastasi neutrofila (NE), catepsina G (CG), proteinasi 3, lattoferrina, gelatinasi, mieloperossidasi (MPO) e peptidi antimicrobici (AMP) come il peptide pro-infiammatorio cationico catelicidina LL-37 tra gli altri ^8,9. Tali aggregati possono formare fili più grandi con diametri fino a 50 nm. Questi fattori possono interrompere i fattori di virulenza microbica o l’integrità della membrana cellulare patogena; inoltre, gli AMP possono stabilizzare il DNA derivato dal NET contro la degradazione da parte delle nucleasi batteriche¹⁰.

I meccanismi specifici che regolano la formazione di NET non sono ancora stati completamente chiariti. La via meglio caratterizzata che porta al rilascio di NET è attraverso la segnalazione ERK, che porta all’attivazione della NADPH ossidasi e alla produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), nonché all’aumento del calcio intracellulare che innesca l’attivazione della via MPO. Questo a sua volta trasforma il perossido di idrogeno in acido ipocloroso, attivando NE per ossidazione^11,12. NE è responsabile della degradazione dei filamenti di actina del citoscheletro per bloccare la fagocitosi e della loro traslocazione al nucleo per l’elaborazione mediante scissione proteolitica e deaminazione da parte di PAD4 che guidano la desensibilizzazione delle fibre di cromatina, che si associano a proteine granulari e citoplasmatiche, e vengono quindi rilasciate extracellulare⁷. Queste proteasi includono quelle rilasciate dal complesso degli azurosomi dei granuli azurofili e altre proteasi come la catepsina G¹³.

A seconda dei cambiamenti morfologici nei neutrofili, i NET sono classificati in due tipi: formazione di NET suicidaria o litica che porta alla morte cellulare⁴ e formazione di NET vitale o non litica prodotta da cellule vitali mediate da un rilascio vescicolare di DNA nucleare o mitocondriale, con un residuo di un citoplasto anucleato con capacità fagocitaria^14,15. Generalmente, i NET composti da DNA mitocondriale presentano una morfologia allungata della fibra¹⁴, mentre quelli strutturati di DNA nucleare hanno un aspetto simile a una nuvola³. Tuttavia, non è noto come il neutrofilo scelga la sua origine del DNA. Contrariamente a studi precedenti che descrivevano i percorsi canonici dei NET come se richiedessero diverse ore, il percorso vitale viene rapidamente attivato in soli 5-60 minuti^{e 15}.

Nonostante questi progressi, la composizione NET varia a seconda dello stimolo; ad esempio, diversi ceppi mucoidi e non mucoidi di P. aeruginosa inducono la formazione di NET contenenti 33 proteine comuni e fino a 50 proteine variabili⁷. Pertanto, è necessario omogeneizzare le tecniche che consentono la generazione di conclusioni oggettive nei gruppi di ricerca. Questo articolo descrive un protocollo con varie tecniche che consentono il confronto e la valutazione della composizione, della struttura e della morfologia dei NET indotti con diversi microrganismi: Staphylococcus aureus (batterio gram-positivo), Pseudomonas aeruginosa (batterio gram-negativo) e Candida albicans (fungo), nonché stimoli chimici (PMA, HOCl) in neutrofili umani da individui sani. I risultati rappresentativi dimostrano l’eterogeneità dei NET a seconda del loro stimolo inducente in condizioni comparabili in vitro, caratterizzate da colorazione DNA-DAPI, immunocolorazione per LL37 e quantificazione dell’attività enzimatica (NE, CG e MPO).

Protocol

I campioni di sangue sono stati ottenuti come donazioni da partecipanti clinicamente sani dopo il consenso informato. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti con il permesso del Comitato Etico di Ricerca Umana della Facoltà di Scienze Biochimiche, Universidad Autónoma ‘Benito Juárez’ di Oaxaca. NOTA: I criteri di inclusione nello studio erano sesso ed età indistinti e clinicamente sani in base alle risposte dei partecipanti a un questionario prima di prelevare un campione di sangue. È s…

Representative Results

Purezza e vitalità dei neutrofiliLe fasi cellulari dinamiche sono visualizzate nel tubo dalla purificazione a gradiente a doppia densità. All’interno di questi strati, lo strato corrispondente ai granulociti è al di sopra dello strato di densità di 1,079 g/ml, distinto dalle fasi dei mononucleociti del sangue periferico (PBMC) e degli eritrociti (Figura 1A). La morfologia delle cellule purificate è stata verificata con la colorazione di Wright osservando cellule con…

Discussion

Una popolazione altamente pura di neutrofili vitali deve essere ottenuta per indurre il rilascio di NET poiché queste cellule hanno una durata ex vivo limitata di 8 ore in media, un periodo entro il quale devono essere eseguiti tutti gli esperimenti. A tal fine, la metodologia ideale è il gradiente a doppia densità per ottimizzare il tempo di purificazione isolando cellule non attivate più sensibili alla stimolazione esogena, in contrasto con le tecniche di sedimentazione del gradiente di Ficoll-Histopaque o…

Materials

24 Well plate for cell culture	Corning	3526
7-aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Pharmingen	51-668981E
96 Well plate for cell culture	Costar	3596	Flat bottom
Agitator	CRM Globe	CRM-OS1
Antibody LL37	Santa Cruz Biotechnology	sc-166770
Blood collection tubes	BD VACUTAINER	368171	K2 EDTA 7.2 mg
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Sigma-Aldrich	21878
Centrifuge	Hettich	1406-01
Coverslip	Madesa	M03-CUB-22X22	22 mm x 22 mm
Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS)	Caisson	1201022
Falcon tubes 50 mL	CORNING	430829
Flow Cytometry Tubes	Miltenyi Biotec		5 mL – Without caps
FlowJo Software	BD Biosciences		Analyze flow cytometry data
Fluorescence microscope	DM 2000	LEICA
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Incubator	NUAIRE	UN-4750
MACSQuant Analyzer	Miltenyi Biotec		Flow cytometer
Microplate reader photometer	Clarkson Laboratory – CL
Microtubes 1.5 mL	Zhejiang Runlab Tech	35200N	wire snap
Minitab Software	Minitab		Statistical analysis
Needles	BD VACUTAINER	301746	Diameter 1.34 mm
Optical microscope	VELAB	VE-B50
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	Solution for density gradient
Phosphate Buffered Saline (10x)	Caisson	PBL07-500ML
Pyrex culture tubes	CORNING	CLS982025	N°9820
RPMI 1640 1x	Corning	10-104-CV	contains Glutagro
Slides	Madesa	PDI257550	22 mm x 75 mm
Trypan Blue solution 0.4%	SIGMA	T8154-100ML