Dynamisk samling i realtid af hippocampus ekstracellulær væske fra bevidste rotter ved hjælp af et mikrodialysesystem
Summary
Protokollen her giver en detaljeret dynamisk prøveudtagning i realtid af ekstracellulær væske fra hippocampus hos vågne rotter ved hjælp af et mikrodialysesystem.
Abstract
En række sygdomme i centralnervesystemet (CNS) er forbundet med ændringer i sammensætningen af hippocampus ekstracellulær væske (HECF). Imidlertid har vanskeligheder med at opnå HECF i realtid fra bevidste rotter længe begrænset evalueringen af CNS-sygdomsprogression og effektiviteten af etnomedicinsk terapi. Det er opmuntrende, at en hjernemikrodialyseteknik kan anvendes til kontinuerlig prøveudtagning med fordelene ved dynamisk observation, kvantitativ analyse og en lille prøveudtagningsstørrelse. Dette muliggør overvågning af ændringer i det ekstracellulære væskeindhold for forbindelser fra traditionelle urter og deres metabolitter i hjernen hos levende dyr. Formålet med denne undersøgelse var således nøjagtigt at implantere en cerebrospinalvæskemikrodialysesonde i hippocampusområdet hos Sprague Dawley (SD) rotter med et tredimensionelt hjernestereotaksisk apparat, der afskærer molekylvægte større end 20 kDa. HECF af høj kvalitet blev derefter opnået fra bevidste rotter ved hjælp af et mikrodialyseprøvetagningskontrolsystem med en justerbar prøveudtagningshastighed fra 2,87 nL / min – 2,98 ml / min. Afslutningsvis giver vores protokol en effektiv, hurtig og dynamisk metode til at opnå HECF hos vågne rotter ved hjælp af mikrodialyseteknologi, som giver os ubegrænsede muligheder for yderligere at udforske patogenesen af CNS-relaterede sygdomme og evaluere lægemiddeleffektivitet.
Introduction
Centralnervesystemet (CNS) sygdomme med høj sygelighed, såsom neurodegenerativ sygdom, traumatisk hjerneskade, hypoxi-induceret hjerneskade i stor højde og iskæmisk slagtilfælde, er afgørende årsager til den voksende dødelighed på verdensplan 1,2,3. Realtidsovervågning af cytokiner og proteinændringer i specifikke hjerneområder bidrager til diagnostisk nøjagtighed af CNS-sygdomme og hjernefarmakokinetiske undersøgelser efter medicinering. Traditionel videnskabelig forskning anvender hjernevævshomogenat eller en manuel indsamling af interstitiel hjernevæske fra dyr til påvisning af specifikke stoffer og til farmakokinetiske undersøgelser. Dette har dog nogle mangler, såsom en begrænset stikprøvestørrelse, manglende evne til dynamisk at observere ændringer i indikatorer og ujævn stikprøvekvalitet 4,5,6. Cerebrospinalvæske, en interstitiel væske, beskytter hjernen og rygmarven mod mekanisk skade. Dens sammensætning er forskellig fra serumets på grund af eksistensen af blod-hjerne-barrieren (BBB)7. Direkte analyse af cerebrospinalvæskeprøver er mere befordrende for at afsløre mekanismen for CNS-læsioner og lægemiddelopdagelse. Uundgåeligt har cerebrospinalvæskeprøverne, manuelt opnået direkte fra cisterna magna og cerebrale ventrikler gennem en sprøjte, ulemper ved blodforurening, en tilfældig chance for prøveindsamling, usikkerhed om mængde og næsten ingen mulighed for multipel hentning 8,9. Mere bemærkelsesværdigt kan konventionelle interstitielle hjernevæskeprøveudtagningsmetoder ikke få prøver fra beskadigede hjerneområder, hvilket hindrer udforskningen af patogenesen af CNS-sygdomme i specifikke hjerneområder og effektivitetsevalueringen af målrettede etnomedicinbehandlinger 9,10.
Hjernemikrodialyse er en teknik til prøveudtagning af interstitiel hjernevæske hos vågne dyr11. Mikrodialysesystemet efterligner vaskulær permeabilitet ved hjælp af en sonde implanteret i hjernen. Mikrodialysesonden er bevæbnet med en semipermeabel membran og implanteres i specifikke hjerneområder. Efter perfusion med isotonisk kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) kan den dialyserede interstitielle hjernevæske med fordel opsamles med fordelene ved små prøvestørrelser, kontinuerlig prøveudtagning og dynamisk observation12,13. Med hensyn til placering kan hjernemikrodialyseprober selektivt implanteres i hjernestrukturer eller kraniale cisterner af interesse14. En observation af unormale niveauer af et endogent stof i hippocampus ekstracellulær væske (HECF) antyder forekomsten af CNS-sygdomme eller patogenesen af sygdom. Flere undersøgelser har vist, at biomarkørerne for CNS-sygdomme, såsom D-aminosyrer i skizofreni, β-amyloid- og tau-proteiner i Alzheimers sygdom, neurofilament-lyskæder i traumatisk hjerneskade og ubiquitincarboxy-terminal hydrolase L1’er i hypoxisk iskæmi encephalopati, kan analyseres i cerebrospinalvæske15,16,17 . En kemisk analysemetode baseret på hjernens mikrodialyseprøveudtagningsteknik kan bruges til at overvåge dynamiske ændringer af eksogene forbindelser såsom aktive ingredienser i etnomedicin, som diffunderer og distribuerer i specifikke hjerneområder14.
Denne artikel præsenterer den specifikke proces med dynamisk HECF-erhvervelse i vågne rotter og måler dets osmotiske tryk for at sikre prøvekvaliteten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Patogenesen af CNS-sygdomme er stadig ikke fuldt ud forstået, hvilket forhindrer udviklingen af nye terapier og lægemidler. Undersøgelser har vist, at de fleste CNS-sygdomme er tæt forbundet med hippocampale læsioner20,21,22. Den foreslåede hjernemikrodialyseteknik kan målrette mod bestemte områder af hjernen, især hippocampus, hvilket gør det skiller sig ud fra den traditionelle tilgang til indsamling af HECF. Sonder …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82104533), Science & Technology Department of Sichuan-provinsen (2021YJ0175) og China Postdoctoral Science Foundation (2020M683273). Forfatterne vil gerne takke Mr. Yuncheng Hong, en senior udstyrsingeniør hos Tri-Angels D&H Trading Pte. Ltd. (Singapore) til levering af tekniske tjenester til mikrodialyseteknikken.
Materials
| Air-drying oven | Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd | GHG-9240A | |
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | Beijing leagene biotech. Co., Ltd | CZ0522 | |
| Brain microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Covance infusion harness | Instech Laboratories, Inc. | CIH95 | |
| Denture base resins | Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd | 190732 | |
| Electric cranial drill | Rayward Life Technology Co., Ltd | 78001 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd | H51021208 | |
| Iodophor | Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd | 202201 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Microdialysis catheter stylet | CMA Microdialysis AB | 8011205 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Osmometer | Löser | OM 807 | |
| Sodium hyaluronate eye drops | URSAPHARM Arzneimittel GmbH | H20150150 | |
| Stereotaxie apparatus | Rayward Life Technology Co., Ltd | 68025 | |
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Trypsin solution | Boster Biological Technology, Ltd. |
PYG0107 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
Referências
- Erkkinen, M. G., Kim, M. O., Geschwind, M. D. Clinical neurology and epidemiology of the major neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 033118 (2018).
- Salehi, A., Zhang, J. H., Obenaus, A. Response of the cerebral vasculature following traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2320-2339 (2017).
- Kurtzman, R. A. e. m. 3., Caruso, J. L. High-altitude illness death investigation. Academic Forensic Pathology. 8 (1), 83-97 (2018).
- Matsumoto, T., et al. Pharmacokinetic study of Ninjin’yoeito: Absorption and brain distribution of Ninjin’yoeito ingredients in mice. Journal of Ethnopharmacology. 279, 114332 (2021).
- Mahat, M. Y., et al. An improved method of transcutaneous cisterna magna puncture for cerebrospinal fluid sampling in rats. Journal of Neuroscience Methods. 211 (2), 272-279 (2012).
- Ceaglio, N., et al. High performance collection of cerebrospinal fluid in rats: evaluation of erythropoietin penetration after osmotic opening of the blood-brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 219 (1), 70-75 (2013).
- Bothwell, S. W., Janigro, D., Patabendige, A. Cerebrospinal fluid dynamics and intracranial pressure elevation in neurological diseases. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 9 (2019).
- Barthel, L., et al. A step-by-step guide for microsurgical collection of uncontaminated cerebrospinal fluid from rat cisterna magna. Journal of Neuroscience Methods. 352, 109085 (2021).
- Zhao, Y., Yang, Y., Wang, D. X., Wang, J., Gao, W. Y. Cerebrospinal fluid amino acid metabolite signatures of diabetic cognitive dysfunction based on targeted mass spectrometry. Journal of Alzheimer’s Disease. 86 (4), 1655-1665 (2022).
- Lim, N. K., et al. An improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice. Journal of Visualized Experiments. (133), e56774 (2018).
- Hendrickx, S., et al. A sensitive capillary LC-UV method for the simultaneous analysis of olanzapine, chlorpromazine and their FMO-mediated N-oxidation products in brain microdialysates. Talanta. 162, 268-277 (2017).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Current Protocols in Neuroscience. , (2009).
- Hammarlund-Udenaes, M. Microdialysis as an important technique in systems pharmacology-a historical and methodological review. The AAPS Journal. 19 (5), 1294-1303 (2017).
- Anderzhanova, E., Wotjak, C. T. Brain microdialysis and its applications in experimental neurochemistry. Cell and Tissue Research. 354 (1), 27-39 (2013).
- Mohammadi, A., Rashidi, E., Amooeian, V. G. Brain, blood, cerebrospinal fluid, and serum biomarkers in schizophrenia. Psychiatry Research. 265, 25-38 (2018).
- Lashley, T., et al. Molecular biomarkers of Alzheimer’s disease: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 11 (5), 031781 (2018).
- Kawata, K., Tierney, R., Langford, D. Blood and cerebrospinal fluid biomarkers. Handbook of Clinical Neurology. 158, 217-233 (2018).
- Zhao, Q. P., et al. Protective effects of dehydrocostuslactone on rat hippocampal slice injury induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation. International Journal of Molecular Medicine. 42 (2), 1190-1198 (2018).
- Wang, X. B. . Protective effects of dehydrocostuslactone on oxygen-glucose deprivation injury in rat hippocampal slices. , (2017).
- Coimbra-Costa, D., Alva, N., Duran, M., Carbonell, T., Rama, R. Oxidative stress and apoptosis after acute respiratory hypoxia and reoxygenation in rat brain. Redox Biology. 12, 216-225 (2017).
- Liu, H. Y., Chou, K. H., Chen, W. T. Migraine and the Hippocampus. Current Pain and Headache Reports. 22 (2), 13 (2018).
- Toda, T., Parylak, S. L., Linker, S. B., Gage, F. H. The role of adult hippocampal neurogenesis in brain health and disease. Molecular Psychiatry. 24 (1), 67-87 (2019).
- Wang, P., Lo Cascio, F., Gao, J., Kayed, R., Huang, X. F., F, X. Binding and neurotoxicity mitigation of toxic tau oligomers by synthetic heparin like oligosaccharides. Chemical Communications. 54 (72), 10120-10123 (2018).
- Han, J. Y., Li, Q., Ma, Z. Z., Fan, J. Y. Effects and mechanisms of compound Chinese medicine and major ingredients on microcirculatory dysfunction and organ injury induced by ischemia/reperfusion. Pharmacology & Therapeutics. 177, 146-173 (2017).
- Peng, T. M., et al. Anti-inflammatory effects of traditional Chinese medicines on preclinical in vivo models of brain ischemia-reperfusion-injury: Prospects for neuroprotective drug discovery and therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 204 (2019).
- König, M., Thinnes, A., Klein, J. Microdialysis and its use in behavioural studies: Focus on acetylcholine. Journal of Neuroscience Methods. 300, 206-215 (2018).
- Liu, M. Z., Wang, P., Yu, X. M., Dong, G. C., Yue, J. Intracerebral microdialysis coupled to LC-MS/MS for the determination tramadol and its major pharmacologically active metabolite O-desmethyltramadol in rat brain microdialysates. Drug Testing and Analysis. 9 (8), 1243-1250 (2017).
- de Lima Oliveira, M., et al. Cerebral microdialysis in traumatic brain injury and subarachnoid hemorrhage: state of the art. Neurocritical Care. 21 (1), 152-162 (2014).
- Amiridze, N., Dang, Y., Brown, O. R. Hydroxyl radicals detected via brain microdialysis in rats breathing air and during hyperbaric oxygen convulsions. Redox Report. 4 (4), 165-170 (1999).
- Chang, H. Y., Morrow, K., Bonacquisti, E., Zhang, W., Shah, D. K. Antibody pharmacokinetics in rat brain determined using microdialysis. MABS. 10 (6), 843-853 (2018).
- Wan, H. Y., et al. Pharmacokinetics of seven major active components of Mahuang decoction in rat blood and brain by LC-MS/MS coupled to microdialysis sampling. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 393 (8), 1559-1571 (2020).
- Zheng, H. Z., et al. Pharmacokinetic analysis of Huangqi Guizhi Wuwu decoction on blood and brain tissue in rats with normal and cerebral ischemia-reperfusion Injury by microdialysis with HPLC-MS/MS. Drug Design Development and Therapy. 14, 2877-2888 (2020).
- Bongaerts, J., et al. Sensitive targeted methods for brain metabolomic studies in microdialysis samples. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 161, 192-205 (2018).
- Zhang, Y. Q., Jiang, N., Yetisen, A. K. Brain neurochemical monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 189, 113351 (2021).
