Dynamische Echtzeit-Entnahme von extrazellulärer Flüssigkeit aus dem Hippocampus von bewussten Ratten mit Hilfe eines Mikrodialysesystems
Summary
Das vorliegende Protokoll bietet eine detaillierte dynamische Echtzeit-Probenahme von extrazellulärer Flüssigkeit aus dem Hippocampus wacher Ratten unter Verwendung eines Mikrodialysesystems.
Abstract
Eine Vielzahl von Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS) ist mit Veränderungen in der Zusammensetzung der extrazellulären Flüssigkeit des Hippocampus (HECF) verbunden. Die Schwierigkeit, HECF in Echtzeit von bewussten Ratten zu erhalten, hat jedoch lange Zeit die Bewertung des Fortschreitens der ZNS-Erkrankung und die Wirksamkeit der ethnomedizinischen Therapie eingeschränkt. Ermutigend ist, dass eine Gehirnmikrodialysetechnik für die kontinuierliche Probenahme mit den Vorteilen der dynamischen Beobachtung, der quantitativen Analyse und einer kleinen Stichprobengröße verwendet werden kann. Dies ermöglicht die Überwachung von Veränderungen des extrazellulären Flüssigkeitsgehalts für Verbindungen aus traditionellen Kräutern und deren Metaboliten im Gehirn lebender Tiere. Das Ziel dieser Studie war es daher, eine Mikrodialysesonde für die Zerebrospinalflüssigkeit mit einem dreidimensionalen stereotaktischen Apparat des Gehirns präzise in die Hippocampusregion von Sprague-Dawley-Ratten zu implantieren, die Molekulargewichte von mehr als 20 kDa abschneidet. Das hochwertige HECF wurde dann von bewussten Ratten mit einem Mikrodialyse-Probenahmekontrollsystem mit einer einstellbaren Probenahmerate von 2,87 nL/min – 2,98 mL/min gewonnen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser Protokoll eine effiziente, schnelle und dynamische Methode zur Gewinnung von HECF bei wachen Ratten mit Hilfe der Mikrodialysetechnologie bietet, die uns unbegrenzte Möglichkeiten bietet, die Pathogenese von ZNS-bedingten Erkrankungen weiter zu erforschen und die Wirksamkeit von Medikamenten zu bewerten.
Introduction
Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS) mit hoher Morbidität, wie neurodegenerative Erkrankungen, Schädel-Hirn-Trauma, Hypoxie-induzierte Hirnverletzungen in großer Höhe und ischämischer Schlaganfall, sind entscheidende Ursachen für die weltweit steigende Sterblichkeit 1,2,3. Die Echtzeitüberwachung von Zytokinen und Proteinveränderungen in bestimmten Hirnregionen trägt zur diagnostischen Genauigkeit von ZNS-Erkrankungen und pharmakokinetischen Untersuchungen des Gehirns nach Medikation bei. In der traditionellen wissenschaftlichen Forschung wird das Homogenat von Hirngewebe oder eine manuelle Entnahme von interstitieller Hirnflüssigkeit von Tieren zum Nachweis spezifischer Substanzen und für pharmakokinetische Studien verwendet. Dies weist jedoch einige Mängel auf, wie z. B. eine begrenzte Stichprobengröße, die Unfähigkeit, die Änderungen der Indikatoren dynamisch zu beobachten, und eine ungleichmäßige Stichprobenqualität 4,5,6. Liquor, eine interstitielle Flüssigkeit, schützt Gehirn und Rückenmark vor mechanischen Schäden. Seine Zusammensetzung unterscheidet sich von der des Serums aufgrund des Vorhandenseins der Blut-Hirn-Schranke (BHS)7. Die direkte Analyse von Liquorproben ist eher geeignet, um den Mechanismus von ZNS-Läsionen und die Entdeckung von Medikamenten aufzudecken. Die Liquorproben, die manuell direkt aus der Cisterna magna und den Hirnventrikeln über eine Spritze entnommen werden, weisen zwangsläufig Nachteile der Blutkontamination, eine zufällige Chance auf Probenentnahme, eine Unsicherheit der Menge und fastkeine Möglichkeit der Mehrfachentnahme auf 8,9. Insbesondere können mit herkömmlichen interstitiellen Methoden zur Entnahme von Hirnflüssigkeit keine Proben aus geschädigten Hirnregionen entnommen werden, was die Erforschung der Pathogenese von ZNS-Erkrankungen in bestimmten Hirnregionen und die Wirksamkeitsbewertung gezielter ethnomedizinischer Therapien behindert 9,10.
Die Mikrodialyse des Gehirns ist eine Technik zur Entnahme von interstitieller Hirnflüssigkeit bei wachen Tieren11. Das Mikrodialysesystem imitiert die Gefäßpermeabilität mit Hilfe einer im Gehirn implantierten Sonde. Die Mikrodialysesonde ist mit einer semipermeablen Membran ausgestattet und wird in bestimmte Hirnregionen implantiert. Nach Perfusion mit isotonischem künstlichem Liquor cerebrospinalis (ACSF) kann die dialysierte interstitielle Hirnflüssigkeit mit den Vorteilen kleiner Probengrößen, kontinuierlicher Probenahme und dynamischer Beobachtung günstig entnommen werden12,13. In Bezug auf die Lokalisation können Hirnmikrodialysesonden selektiv in Gehirnstrukturen oder Schädelzisternen implantiert werden14. Die Beobachtung abnormer Konzentrationen einer körpereigenen Substanz in der extrazellulären Flüssigkeit des Hippocampus (HECF) deutet auf das Auftreten von ZNS-Erkrankungen oder die Pathogenese der Erkrankung hin. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Biomarker für ZNS-Erkrankungen, wie z. B. D-Aminosäuren bei Schizophrenie, β-Amyloid- und Tau-Proteine bei der Alzheimer-Krankheit, Neurofilament-Leichtketten bei traumatischen Hirnverletzungen und Ubiquitin-Carboxy-terminale Hydrolase L1s bei hypoxischer Ischämie-Enzephalopathie, im Liquor cerebrospinalis analysiert werdenkönnen 15,16,17 . Eine chemische Analysemethode, die auf der Mikrodialyse-Probenahmetechnik des Gehirns basiert, kann verwendet werden, um dynamische Veränderungen exogener Verbindungen, wie z. B. Wirkstoffe der Ethnomedizin, zu überwachen, die in bestimmten Hirnregionen diffundieren und verteilen14.
In diesem Artikel wird der spezifische Prozess der dynamischen HECF-Erfassung bei wachen Ratten vorgestellt und der osmotische Druck gemessen, um die Probenqualität sicherzustellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Pathogenese von ZNS-Erkrankungen ist noch nicht vollständig verstanden, was die Entwicklung neuer Therapien und Medikamente behindert. Studien haben gezeigt, dass die meisten ZNS-Erkrankungen eng mit Hippocampusläsionen verbunden sind20,21,22. Die vorgeschlagene Mikrodialysetechnik des Gehirns kann auf bestimmte Regionen des Gehirns abzielen, insbesondere auf den Hippocampus, was sie von der traditionellen Methode der HECF…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82104533), dem Science &; Technology Department der Provinz Sichuan (2021YJ0175) und der China Postdoctoral Science Foundation (2020M683273) unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei Herrn Yuncheng Hong, einem leitenden Ausrüstungsingenieur bei Tri-Angels D&H Trading Pte. Ltd. (Singapur) für die Erbringung technischer Dienstleistungen für die Mikrodialysetechnik.
Materials
| Air-drying oven | Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd | GHG-9240A | |
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | Beijing leagene biotech. Co., Ltd | CZ0522 | |
| Brain microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Covance infusion harness | Instech Laboratories, Inc. | CIH95 | |
| Denture base resins | Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd | 190732 | |
| Electric cranial drill | Rayward Life Technology Co., Ltd | 78001 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd | H51021208 | |
| Iodophor | Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd | 202201 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Microdialysis catheter stylet | CMA Microdialysis AB | 8011205 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Osmometer | Löser | OM 807 | |
| Sodium hyaluronate eye drops | URSAPHARM Arzneimittel GmbH | H20150150 | |
| Stereotaxie apparatus | Rayward Life Technology Co., Ltd | 68025 | |
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Trypsin solution | Boster Biological Technology, Ltd. |
PYG0107 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
Referências
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