איסוף דינמי בזמן אמת של נוזל חוץ-תאי בהיפוקמפוס מחולדות מודעות באמצעות מערכת מיקרודיאליזה
Summary
הפרוטוקול כאן מספק דגימה דינמית מפורטת בזמן אמת של נוזל חוץ-תאי מההיפוקמפוס של חולדות ערות באמצעות מערכת מיקרודיאליזה.
Abstract
מגוון מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) קשורות לשינויים בהרכב הנוזל החוץ תאי בהיפוקמפוס (HECF). עם זאת, קושי בהשגת HECF בזמן אמת מחולדות מודעות הגביל זה מכבר את הערכת התקדמות המחלה במערכת העצבים המרכזית ואת יעילות הטיפול האתנו-רפואי. באופן מעודד, ניתן להשתמש בטכניקת מיקרודיאליזה מוחית לדגימה רציפה עם היתרונות של תצפית דינמית, ניתוח כמותי וגודל דגימה קטן. זה מאפשר ניטור של שינויים בתכולת הנוזל החוץ תאי עבור תרכובות מצמחי מרפא מסורתיים והמטבוליטים שלהם במוחם של בעלי חיים חיים. מטרת מחקר זה הייתה להשתיל במדויק גשושית מיקרודיאליזה של נוזל מוחי שדרתי באזור ההיפוקמפוס של חולדות Sprague Dawley (SD) עם מנגנון סטריאוטקסי תלת-ממדי במוח, תוך חיתוך משקלים מולקולריים הגדולים מ-20 kDa. ה-HECF האיכותי התקבל מחולדות מודעות באמצעות מערכת בקרת דגימת מיקרודיאליזה עם קצב דגימה מתכוונן מ-2.87 nL/min – 2.98 מ”ל/דקה. לסיכום, הפרוטוקול שלנו מספק שיטה יעילה, מהירה ודינמית להשגת HECF בחולדות ערות בעזרת טכנולוגיית מיקרודיאליזה, המספקת לנו אפשרויות בלתי מוגבלות להמשיך לחקור את הפתוגנזה של מחלות הקשורות למערכת העצבים המרכזית ולהעריך את יעילות התרופות.
Introduction
מחלות מערכת העצבים המרכזית (CNS) עם תחלואה גבוהה, כגון מחלות נוירודגנרטיביות, פגיעה מוחית טראומטית, פגיעה מוחית הנגרמת על ידי היפוקסיה בגובה רב ושבץ איסכמי, הן סיבות מכריעות לתמותה הגוברת ברחבי העולם 1,2,3. ניטור בזמן אמת של ציטוקינים ושינויים חלבוניים באזורים מסוימים במוח תורם לדיוק האבחנתי של מחלות CNS ומחקרים פרמקוקינטיים במוח לאחר תרופות. המחקר המדעי המסורתי משתמש בהומוגנט של רקמת המוח או באוסף ידני של נוזל מוח אינטרסטיציאלי של בעלי חיים לזיהוי חומרים ספציפיים ולמחקרים פרמקוקינטים. עם זאת, יש לכך כמה חסרונות, כגון גודל מדגם מוגבל, חוסר היכולת לצפות באופן דינמי בשינויים של אינדיקטורים, ואיכות דגימה לא אחידה 4,5,6. נוזל מוחי שדרתי, נוזל אינטרסטיציאלי, מגן על המוח וחוט השדרה מפני נזק מכני. הרכבו שונה מזה של הסרום בשל קיומו של מחסום הדם-מוח (BBB)7. ניתוח ישיר של דגימות נוזל מוחי שדרתי תורם יותר לחשיפת המנגנון של נגעים במערכת העצבים המרכזית וגילוי תרופות. באופן בלתי נמנע, דגימות נוזל המוח השדרה, המתקבלות באופן ידני ישירות מן cisterna magna וחדרי המוח דרך מזרק, יש חסרונות של זיהום דם, סיכוי אקראי של איסוף דגימה, אי ודאות של כמות, וכמעט ללא אפשרות שליפה מרובה 8,9. חשוב מכך, שיטות דגימה קונבנציונליות של נוזל מוח אינטרסטיציאלי אינן יכולות להשיג דגימות מאזורי מוח פגועים, מה שמעכב את חקר הפתוגנזה של מחלות CNS באזורי מוח ספציפיים ואת הערכת היעילות של טיפולים אתנו-רפואיים ממוקדים 9,10.
מיקרודיאליזה מוחית היא טכניקה לדגימת נוזל מוח אינטרסטיציאלי בחיות ערות11. מערכת המיקרודיאליזה מחקה חדירות כלי דם בעזרת בדיקה שהושתלה במוח. בדיקת המיקרודיאליזה חמושה בקרום חדיר למחצה ומושתלת באזורי מוח ספציפיים. לאחר זילוח עם נוזל מוחי מלאכותי איזוטוני (ACSF), נוזל המוח הבין-תאי החוגג יכול להיאסף לטובה עם היתרונות של גודל מדגם קטן, דגימה רציפה ותצפית דינמית12,13. במונחים של מיקום, בדיקות מיקרודיאליזה במוח יכולות להיות מושתלות באופן סלקטיבי במבני מוח או בורות גולגולת מעניינים14. תצפית על רמות חריגות של חומר אנדוגני בנוזל החוץ תאי בהיפוקמפוס (HECF) מצביעה על התרחשויות של מחלות CNS או פתוגנזה של מחלות. מספר מחקרים הראו כי הסמנים הביולוגיים למחלות CNS, כגון חומצות אמינו D בסכיזופרניה, חלבוני β-עמילואיד וטאו במחלת אלצהיימר, שרשראות אור נוירופילמנט בפגיעה מוחית טראומטית, ויוביקוויטין קרבוקסי-טרמינל הידרולאז L1s באנצפלופתיה איסכמיה היפוקסית, ניתנים לניתוח בנוזל השדרה15,16,17 . שיטת אנליזה כימית המבוססת על טכניקת דגימת מיקרודיאליזה במוח יכולה לשמש למעקב אחר שינויים דינמיים של תרכובות אקסוגניות כגון חומרים פעילים של אתנורפואה, אשר מתפזרים ומפיצים באזורים ספציפיים במוח14.
מאמר זה מציג את התהליך הספציפי של רכישת HECF דינמי בחולדות ערות ומודד את הלחץ האוסמוטי שלו כדי להבטיח את איכות הדגימה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפתוגנזה של מחלות CNS עדיין לא מובנת במלואה, מה שמעכב את הפיתוח של טיפולים ותרופות חדשות. מחקרים הראו כי רוב מחלות CNS קשורות קשר הדוק נגעים בהיפוקמפוס20,21,22. טכניקת המיקרודיאליזה המוצעת במוח יכולה להתמקד באזורים ספציפיים במוח, במיוחד בהיפוק?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82104533), מחלקת המדע והטכנולוגיה של מחוז סצ’ואן (2021YJ0175), והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2020M683273). המחברים רוצים להודות למר יונצ’נג הונג, מהנדס ציוד בכיר בחברת Tri-Angels D&H Trading Pte. Ltd. (סינגפור) למתן שירותים טכניים לטכניקת המיקרודיאליזה.
Materials
| Air-drying oven | Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd | GHG-9240A | |
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | Beijing leagene biotech. Co., Ltd | CZ0522 | |
| Brain microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Covance infusion harness | Instech Laboratories, Inc. | CIH95 | |
| Denture base resins | Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd | 190732 | |
| Electric cranial drill | Rayward Life Technology Co., Ltd | 78001 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd | H51021208 | |
| Iodophor | Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd | 202201 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Microdialysis catheter stylet | CMA Microdialysis AB | 8011205 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Osmometer | Löser | OM 807 | |
| Sodium hyaluronate eye drops | URSAPHARM Arzneimittel GmbH | H20150150 | |
| Stereotaxie apparatus | Rayward Life Technology Co., Ltd | 68025 | |
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Trypsin solution | Boster Biological Technology, Ltd. |
PYG0107 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
Referências
- Erkkinen, M. G., Kim, M. O., Geschwind, M. D. Clinical neurology and epidemiology of the major neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 033118 (2018).
- Salehi, A., Zhang, J. H., Obenaus, A. Response of the cerebral vasculature following traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2320-2339 (2017).
- Kurtzman, R. A. e. m. 3., Caruso, J. L. High-altitude illness death investigation. Academic Forensic Pathology. 8 (1), 83-97 (2018).
- Matsumoto, T., et al. Pharmacokinetic study of Ninjin’yoeito: Absorption and brain distribution of Ninjin’yoeito ingredients in mice. Journal of Ethnopharmacology. 279, 114332 (2021).
- Mahat, M. Y., et al. An improved method of transcutaneous cisterna magna puncture for cerebrospinal fluid sampling in rats. Journal of Neuroscience Methods. 211 (2), 272-279 (2012).
- Ceaglio, N., et al. High performance collection of cerebrospinal fluid in rats: evaluation of erythropoietin penetration after osmotic opening of the blood-brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 219 (1), 70-75 (2013).
- Bothwell, S. W., Janigro, D., Patabendige, A. Cerebrospinal fluid dynamics and intracranial pressure elevation in neurological diseases. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 9 (2019).
- Barthel, L., et al. A step-by-step guide for microsurgical collection of uncontaminated cerebrospinal fluid from rat cisterna magna. Journal of Neuroscience Methods. 352, 109085 (2021).
- Zhao, Y., Yang, Y., Wang, D. X., Wang, J., Gao, W. Y. Cerebrospinal fluid amino acid metabolite signatures of diabetic cognitive dysfunction based on targeted mass spectrometry. Journal of Alzheimer’s Disease. 86 (4), 1655-1665 (2022).
- Lim, N. K., et al. An improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice. Journal of Visualized Experiments. (133), e56774 (2018).
- Hendrickx, S., et al. A sensitive capillary LC-UV method for the simultaneous analysis of olanzapine, chlorpromazine and their FMO-mediated N-oxidation products in brain microdialysates. Talanta. 162, 268-277 (2017).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Current Protocols in Neuroscience. , (2009).
- Hammarlund-Udenaes, M. Microdialysis as an important technique in systems pharmacology-a historical and methodological review. The AAPS Journal. 19 (5), 1294-1303 (2017).
- Anderzhanova, E., Wotjak, C. T. Brain microdialysis and its applications in experimental neurochemistry. Cell and Tissue Research. 354 (1), 27-39 (2013).
- Mohammadi, A., Rashidi, E., Amooeian, V. G. Brain, blood, cerebrospinal fluid, and serum biomarkers in schizophrenia. Psychiatry Research. 265, 25-38 (2018).
- Lashley, T., et al. Molecular biomarkers of Alzheimer’s disease: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 11 (5), 031781 (2018).
- Kawata, K., Tierney, R., Langford, D. Blood and cerebrospinal fluid biomarkers. Handbook of Clinical Neurology. 158, 217-233 (2018).
- Zhao, Q. P., et al. Protective effects of dehydrocostuslactone on rat hippocampal slice injury induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation. International Journal of Molecular Medicine. 42 (2), 1190-1198 (2018).
- Wang, X. B. . Protective effects of dehydrocostuslactone on oxygen-glucose deprivation injury in rat hippocampal slices. , (2017).
- Coimbra-Costa, D., Alva, N., Duran, M., Carbonell, T., Rama, R. Oxidative stress and apoptosis after acute respiratory hypoxia and reoxygenation in rat brain. Redox Biology. 12, 216-225 (2017).
- Liu, H. Y., Chou, K. H., Chen, W. T. Migraine and the Hippocampus. Current Pain and Headache Reports. 22 (2), 13 (2018).
- Toda, T., Parylak, S. L., Linker, S. B., Gage, F. H. The role of adult hippocampal neurogenesis in brain health and disease. Molecular Psychiatry. 24 (1), 67-87 (2019).
- Wang, P., Lo Cascio, F., Gao, J., Kayed, R., Huang, X. F., F, X. Binding and neurotoxicity mitigation of toxic tau oligomers by synthetic heparin like oligosaccharides. Chemical Communications. 54 (72), 10120-10123 (2018).
- Han, J. Y., Li, Q., Ma, Z. Z., Fan, J. Y. Effects and mechanisms of compound Chinese medicine and major ingredients on microcirculatory dysfunction and organ injury induced by ischemia/reperfusion. Pharmacology & Therapeutics. 177, 146-173 (2017).
- Peng, T. M., et al. Anti-inflammatory effects of traditional Chinese medicines on preclinical in vivo models of brain ischemia-reperfusion-injury: Prospects for neuroprotective drug discovery and therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 204 (2019).
- König, M., Thinnes, A., Klein, J. Microdialysis and its use in behavioural studies: Focus on acetylcholine. Journal of Neuroscience Methods. 300, 206-215 (2018).
- Liu, M. Z., Wang, P., Yu, X. M., Dong, G. C., Yue, J. Intracerebral microdialysis coupled to LC-MS/MS for the determination tramadol and its major pharmacologically active metabolite O-desmethyltramadol in rat brain microdialysates. Drug Testing and Analysis. 9 (8), 1243-1250 (2017).
- de Lima Oliveira, M., et al. Cerebral microdialysis in traumatic brain injury and subarachnoid hemorrhage: state of the art. Neurocritical Care. 21 (1), 152-162 (2014).
- Amiridze, N., Dang, Y., Brown, O. R. Hydroxyl radicals detected via brain microdialysis in rats breathing air and during hyperbaric oxygen convulsions. Redox Report. 4 (4), 165-170 (1999).
- Chang, H. Y., Morrow, K., Bonacquisti, E., Zhang, W., Shah, D. K. Antibody pharmacokinetics in rat brain determined using microdialysis. MABS. 10 (6), 843-853 (2018).
- Wan, H. Y., et al. Pharmacokinetics of seven major active components of Mahuang decoction in rat blood and brain by LC-MS/MS coupled to microdialysis sampling. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 393 (8), 1559-1571 (2020).
- Zheng, H. Z., et al. Pharmacokinetic analysis of Huangqi Guizhi Wuwu decoction on blood and brain tissue in rats with normal and cerebral ischemia-reperfusion Injury by microdialysis with HPLC-MS/MS. Drug Design Development and Therapy. 14, 2877-2888 (2020).
- Bongaerts, J., et al. Sensitive targeted methods for brain metabolomic studies in microdialysis samples. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 161, 192-205 (2018).
- Zhang, Y. Q., Jiang, N., Yetisen, A. K. Brain neurochemical monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 189, 113351 (2021).
