Raccolta dinamica in tempo reale di liquido extracellulare ippocampale da ratti coscienti utilizzando un sistema di microdialisi
Summary
Il protocollo qui fornisce un campionamento dinamico dettagliato in tempo reale del fluido extracellulare dall’ippocampo di ratti svegli utilizzando un sistema di microdialisi.
Abstract
Una varietà di malattie del sistema nervoso centrale (SNC) sono associate a cambiamenti nella composizione del fluido extracellulare ippocampale (HECF). Tuttavia, la difficoltà di ottenere HECF in tempo reale da ratti coscienti ha a lungo limitato la valutazione della progressione della malattia del SNC e l’efficacia della terapia etnomedica. Incoraggiante, una tecnica di microdialisi cerebrale può essere utilizzata per il campionamento continuo con i vantaggi dell’osservazione dinamica, dell’analisi quantitativa e di una piccola dimensione del campionamento. Ciò consente il monitoraggio dei cambiamenti nel contenuto di fluido extracellulare per i composti delle erbe tradizionali e dei loro metaboliti nel cervello degli animali viventi. Lo scopo di questo studio era quindi quello di impiantare con precisione una sonda di microdialisi del liquido cerebrospinale nella regione ippocampale dei ratti Sprague Dawley (SD) con un apparato stereotassico cerebrale tridimensionale, tagliando pesi molecolari superiori a 20 kDa. L’HECF di alta qualità è stato quindi ottenuto da ratti coscienti utilizzando un sistema di controllo del campionamento in microdialisi con una frequenza di campionamento regolabile da 2,87 nL / min – 2,98 ml / min. In conclusione, il nostro protocollo fornisce un metodo efficiente, rapido e dinamico per ottenere HECF nei ratti svegli con l’aiuto della tecnologia di microdialisi, che ci offre possibilità illimitate per esplorare ulteriormente la patogenesi delle malattie correlate al SNC e valutare l’efficacia dei farmaci.
Introduction
Le malattie del sistema nervoso centrale (SNC) con elevata morbilità, come le malattie neurodegenerative, le lesioni cerebrali traumatiche, le lesioni cerebrali indotte dall’ipossia ad alta quota e l’ictus ischemico, sono cause cruciali della crescente mortalità in tutto il mondo 1,2,3. Il monitoraggio in tempo reale delle citochine e dei cambiamenti proteici in specifiche regioni del cervello contribuisce all’accuratezza diagnostica delle malattie del SNC e degli studi di farmacocinetica cerebrale dopo i farmaci. La ricerca scientifica tradizionale utilizza l’omogenato del tessuto cerebrale o una raccolta manuale di liquido cerebrale interstiziale animale per la rilevazione di sostanze specifiche e per studi farmacocinetici. Tuttavia, ciò presenta alcune carenze, come una dimensione limitata del campione, l’incapacità di osservare dinamicamente i cambiamenti degli indicatori e una qualità di campionamento non uniforme 4,5,6. Il liquido cerebrospinale, un liquido interstiziale, protegge il cervello e il midollo spinale da danni meccanici. La sua composizione è diversa da quella del siero a causa dell’esistenza della barriera emato-encefalica (BBB)7. L’analisi diretta dei campioni di liquido cerebrospinale è più favorevole alla divulgazione del meccanismo delle lesioni del SNC e alla scoperta di farmaci. Inevitabilmente, i campioni di liquido cerebrospinale, ottenuti manualmente direttamente dalla cisterna magna e dai ventricoli cerebrali attraverso una siringa, presentano svantaggi di contaminazione del sangue, possibilità casuale di raccolta del campione, incertezza della quantità e quasi nessuna possibilità di prelievo multiplo 8,9. Più in particolare, i metodi convenzionali di campionamento dei fluidi cerebrali interstiziali non possono ottenere campioni da regioni cerebrali danneggiate, il che ostacola l’esplorazione della patogenesi delle malattie del SNC in specifiche regioni del cervello e la valutazione dell’efficacia delle terapie etnomediche mirate 9,10.
La microdialisi cerebrale è una tecnica per il campionamento del fluido cerebrale interstiziale negli animali svegli11. Il sistema di microdialisi imita la permeabilità vascolare con l’aiuto di una sonda impiantata nel cervello. La sonda di microdialisi è armata con una membrana semipermeabile e viene impiantata in specifiche regioni del cervello. Dopo la perfusione con liquido cerebrospinale artificiale isotonico (ACSF), il fluido cerebrale interstiziale dializzato può essere raccolto favorevolmente con i benefici di campioni di piccole dimensioni, campionamento continuo e osservazione dinamica12,13. In termini di localizzazione, le sonde di microdialisi cerebrale possono essere impiantate selettivamente in strutture cerebrali o cisterne craniche di interesse14. Un’osservazione di livelli anormali di una sostanza endogena nel liquido extracellulare ippocampale (HECF) suggerisce l’insorgenza di malattie del SNC o la patogenesi della malattia. Diversi studi hanno dimostrato che i biomarcatori per le malattie del SNC, come gli amminoacidi D nella schizofrenia, le proteine β-amiloide e tau nella malattia di Alzheimer, le catene leggere dei neurofilamenti nelle lesioni cerebrali traumatiche e l’ubiquitina carbossi-terminale idrolasi L1 nell’encefalopatia da ischemia ipossica, possono essere analizzati nel liquido cerebrospinale15,16,17 . Un metodo di analisi chimica basato sulla tecnica di campionamento della microdialisi cerebrale può essere utilizzato per monitorare i cambiamenti dinamici di composti esogeni come i principi attivi dell’etnomedicina, che si diffondono e si distribuiscono in specifiche regioni cerebrali14.
Questo articolo presenta il processo specifico di acquisizione dinamica dell’HECF nei ratti svegli e misura la sua pressione osmotica per garantire la qualità del campione.
Protocol
Representative Results
Discussion
La patogenesi delle malattie del SNC non è ancora completamente compresa, il che ostacola lo sviluppo di nuove terapie e farmaci. Gli studi hanno dimostrato che la maggior parte delle malattie del SNC sono strettamente correlate alle lesioni ippocampali20,21,22. La tecnica di microdialisi cerebrale proposta può colpire regioni specifiche del cervello, in particolare l’ippocampo, che lo distingue dall’approccio tradizionale di …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82104533), dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Provincia del Sichuan (2021YJ0175) e dalla China Postdoctoral Science Foundation (2020M683273). Gli autori desiderano ringraziare Yuncheng Hong, ingegnere senior delle attrezzature presso Tri-Angels D&H Trading Pte. Ltd. (Singapore) per la fornitura di servizi tecnici per la tecnica di microdialisi.
Materials
| Air-drying oven | Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd | GHG-9240A | |
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | Beijing leagene biotech. Co., Ltd | CZ0522 | |
| Brain microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Covance infusion harness | Instech Laboratories, Inc. | CIH95 | |
| Denture base resins | Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd | 190732 | |
| Electric cranial drill | Rayward Life Technology Co., Ltd | 78001 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd | H51021208 | |
| Iodophor | Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd | 202201 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Microdialysis catheter stylet | CMA Microdialysis AB | 8011205 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Osmometer | Löser | OM 807 | |
| Sodium hyaluronate eye drops | URSAPHARM Arzneimittel GmbH | H20150150 | |
| Stereotaxie apparatus | Rayward Life Technology Co., Ltd | 68025 | |
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Trypsin solution | Boster Biological Technology, Ltd. |
PYG0107 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
Referências
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