Coleta Dinâmica em Tempo Real de Fluido Extracelular do Hipocampo de Ratos Conscientes Usando um Sistema de Microdiálise
Summary
O protocolo aqui fornece uma amostragem dinâmica detalhada em tempo real do fluido extracelular do hipocampo de ratos acordados usando um sistema de microdiálise.
Abstract
Uma variedade de doenças do sistema nervoso central (SNC) está associada a alterações na composição do líquido extracelular hipocampal (HCEC). No entanto, a dificuldade em obter o HECF em tempo real de ratos conscientes tem restringido por muito tempo a avaliação da progressão da doença do SNC e a eficácia da terapia etnomédica. Encorajadoramente, uma técnica de microdiálise cerebral pode ser usada para amostragem contínua com as vantagens de observação dinâmica, análise quantitativa e um pequeno tamanho de amostragem. Isso permite o monitoramento de mudanças no conteúdo de fluido extracelular para compostos de ervas tradicionais e seus metabólitos no cérebro de animais vivos. O objetivo deste estudo foi, portanto, implantar com precisão uma sonda de microdiálise do líquido cefalorraquidiano na região hipocampal de ratos Sprague Dawley (SD) com um aparelho estereotáxico cerebral tridimensional, cortando pesos moleculares superiores a 20 kDa. O HECF de alta qualidade foi então obtido de ratos conscientes usando um sistema de controle de amostragem de microdiálise com uma taxa de amostragem ajustável de 2,87 nL/min – 2,98 mL/min. Em conclusão, nosso protocolo fornece um método eficiente, rápido e dinâmico para a obtenção do HECF em ratos acordados com a ajuda da tecnologia de microdiálise, o que nos fornece possibilidades ilimitadas para explorar melhor a patogênese das doenças relacionadas ao SNC e avaliar a eficácia das drogas.
Introduction
Doenças do sistema nervoso central (SNC) com alta morbidade, como doenças neurodegenerativas, traumatismo cranioencefálico, lesão cerebral induzida por hipóxia de altitude e acidente vascular cerebral isquêmico, são causas cruciais da crescente mortalidade em todo o mundo 1,2,3. O monitoramento em tempo real de citocinas e alterações proteicas em regiões específicas do cérebro contribui para a precisão diagnóstica de doenças do SNC e estudos farmacocinéticos cerebrais após medicação. A investigação científica tradicional utiliza homogeneizado de tecido cerebral ou uma recolha manual de fluido cerebral intersticial animal para a detecção de substâncias específicas e para estudos farmacocinéticos. No entanto, isso apresenta algumas deficiências, como o tamanho limitado da amostra, a incapacidade de observar dinamicamente as mudanças dos indicadores ea qualidade desigual da amostragem4,5,6. O líquido cefalorraquidiano, um líquido intersticial, protege o cérebro e a medula espinhal de danos mecânicos. Sua composição é diferente da do soro devido à existência da barreira hematoencefálica (BHE)7. A análise direta de amostras de líquido cefalorraquidiano é mais propícia para revelar o mecanismo das lesões do SNC e a descoberta de drogas. Inevitavelmente, as amostras de líquido cefalorraquidiano, obtidas manualmente diretamente da cisterna magna e ventrículos cerebrais através de uma seringa, apresentam desvantagens de contaminação sanguínea, chance aleatória de coleta de amostras, incerteza da quantidade e quase nenhuma possibilidade de recuperação múltipla 8,9. Mais notavelmente, os métodos convencionais de amostragem de fluido cerebral intersticial não podem obter amostras de regiões cerebrais lesadas, o que dificulta a exploração da patogênese de doenças do SNC em regiões específicas do cérebro e a avaliação da eficácia de terapias etnomedicinais direcionadas 9,10.
A microdiálise cerebral é uma técnica de amostragem de fluido cerebral intersticial em animais acordados11. O sistema de microdiálise imita a permeabilidade vascular com a ajuda de uma sonda implantada no cérebro. A sonda de microdiálise é armada com uma membrana semipermeável e é implantada em regiões específicas do cérebro. Após a perfusão com líquido cefalorraquidiano artificial isotônico (LCA), o líquido cerebral intersticial dialisado pode ser obtido favoravelmente com os benefícios de amostras pequenas, amostragem contínua e observação dinâmica12,13. Em termos de localização, sondas de microdiálise cerebral podem ser implantadas seletivamente em estruturas cerebrais ou cisternas cranianas de interesse14. A observação de níveis anormais de uma substância endógena no líquido extracelular hipocampal (HCE) sugere a ocorrência de doenças do SNC ou a patogênese da doença. Vários estudos têm demonstrado que os biomarcadores para doenças do SNC, como os aminoácidos-D na esquizofrenia, as proteínas β-amiloide e tau na doença de Alzheimer, as cadeias leves dos neurofilamentos no traumatismo cranioencefálico e a ubiquitina carboxi-terminal hidrolase L1s na encefalopatia hipóxico-isquêmica, podem ser analisados no líquido cefalorraquidiano15,16,17 . Um método de análise química baseado na técnica de amostragem por microdiálise cerebral pode ser utilizado para monitorar mudanças dinâmicas de compostos exógenos, como princípios ativos da etnomedicina, que se difundem e se distribuem em regiões específicas docérebro14.
Este artigo apresenta o processo específico de aquisição dinâmica do HECF em ratos acordados e mede sua pressão osmótica para garantir a qualidade da amostra.
Protocol
Representative Results
Discussion
A patogênese das doenças do SNC ainda não é totalmente compreendida, o que dificulta o desenvolvimento de novas terapias e fármacos. Estudos têm demonstrado que a maioria das doenças do SNC está intimamente relacionada às lesões hipocampais20,21,22. A técnica de microdiálise cerebral proposta pode ter como alvo regiões específicas do cérebro, especialmente o hipocampo, o que a diferencia da abordagem tradicional d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82104533), pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (2021YJ0175) e pela Fundação de Ciência Pós-Doutoral da China (2020M683273). Os autores gostariam de agradecer ao Sr. Yuncheng Hong, engenheiro de equipamentos sênior da Tri-Angels D&H Trading Pte. Ltd. (Singapura) pela prestação de serviços técnicos para a técnica de microdiálise.
Materials
| Air-drying oven | Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd | GHG-9240A | |
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | Beijing leagene biotech. Co., Ltd | CZ0522 | |
| Brain microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Covance infusion harness | Instech Laboratories, Inc. | CIH95 | |
| Denture base resins | Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd | 190732 | |
| Electric cranial drill | Rayward Life Technology Co., Ltd | 78001 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd | H51021208 | |
| Iodophor | Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd | 202201 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Microdialysis catheter stylet | CMA Microdialysis AB | 8011205 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Osmometer | Löser | OM 807 | |
| Sodium hyaluronate eye drops | URSAPHARM Arzneimittel GmbH | H20150150 | |
| Stereotaxie apparatus | Rayward Life Technology Co., Ltd | 68025 | |
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Trypsin solution | Boster Biological Technology, Ltd. |
PYG0107 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
Referências
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