Dynamisk insamling i realtid av hippocampus extracellulär vätska från medvetna råttor med hjälp av ett mikrodialyssystem
Summary
Protokollet här ger en detaljerad dynamisk provtagning i realtid av extracellulär vätska från hippocampus hos vakna råttor med hjälp av ett mikrodialyssystem.
Abstract
En mängd olika sjukdomar i centrala nervsystemet (CNS) är förknippade med förändringar i sammansättningen av hippocampus extracellulär vätska (HECF). Svårigheten att erhålla HECF i realtid från medvetna råttor har dock länge begränsat utvärderingen av CNS-sjukdomsprogression och effektiviteten av etnomedicinsk behandling. Uppmuntrande nog kan en hjärnmikrodialysteknik användas för kontinuerlig provtagning med fördelarna med dynamisk observation, kvantitativ analys och en liten provtagningsstorlek. Detta möjliggör övervakning av förändringar i det extracellulära vätskeinnehållet för föreningar från traditionella örter och deras metaboliter i hjärnan hos levande djur. Syftet med denna studie var således att noggrant implantera en mikrodialyssond i cerebrospinalvätska i hippocampusregionen hos Sprague Dawley (SD) råttor med en tredimensionell stereotaxisk hjärnapparat, skära av molekylvikter större än 20 kDa. Den högkvalitativa HECF erhölls sedan från medvetna råttor med hjälp av ett mikrodialysprovtagningskontrollsystem med en justerbar samplingsfrekvens från 2,87 nL / min – 2,98 ml / min. Sammanfattningsvis ger vårt protokoll en effektiv, snabb och dynamisk metod för att erhålla HECF hos vakna råttor med hjälp av mikrodialysteknik, vilket ger oss obegränsade möjligheter att ytterligare utforska patogenesen av CNS-relaterade sjukdomar och utvärdera läkemedelseffektivitet.
Introduction
Sjukdomar i centrala nervsystemet (CNS) med hög sjuklighet, såsom neurodegenerativ sjukdom, traumatisk hjärnskada, hypoxiinducerad hjärnskada på hög höjd och ischemisk stroke, är avgörande orsaker till den växande dödligheten över hela världen 1,2,3. Realtidsövervakning av cytokiner och proteinförändringar i specifika hjärnregioner bidrar till diagnostisk noggrannhet av CNS-sjukdomar och farmakokinetiska studier i hjärnan efter medicinering. Traditionell vetenskaplig forskning använder hjärnvävnadshomogenat eller en manuell insamling av djurinterstitiell hjärnvätska för detektion av specifika ämnen och för farmakokinetiska studier. Detta har dock vissa brister, såsom en begränsad urvalsstorlek, oförmågan att dynamiskt observera förändringar av indikatorer och ojämn urvalskvalitet 4,5,6. Cerebrospinalvätska, en interstitiell vätska, skyddar hjärnan och ryggmärgen från mekanisk skada. Dess sammansättning skiljer sig från serumets på grund av förekomsten av blod-hjärnbarriären (BBB)7. Direkt analys av cerebrospinalvätskeprover bidrar mer till att avslöja mekanismen för CNS-lesioner och läkemedelsupptäckt. Oundvikligen har cerebrospinalvätskeproverna, manuellt erhållna direkt från cisterna magna och cerebrala ventriklarna genom en spruta, nackdelar med blodförorening, en slumpmässig chans att ta prov, osäkerhet i kvantitet och nästan ingen multipel hämtningsmöjlighet 8,9. Mer anmärkningsvärt är att konventionella interstitiella provtagningsmetoder för hjärnvätska inte kan få prover från skadade hjärnregioner, vilket hindrar utforskningen av patogenesen av CNS-sjukdomar i specifika hjärnregioner och effektutvärderingen av riktade etnomedicinska terapier 9,10.
Hjärnmikrodialys är en teknik för provtagning av interstitiell hjärnvätska hos vakna djur11. Mikrodialyssystemet imiterar vaskulär permeabilitet med hjälp av en sond implanterad i hjärnan. Mikrodialyssonden är beväpnad med ett semipermeabelt membran och implanteras i specifika hjärnregioner. Efter perfusion med isoton artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) kan den dialyserade interstitiella hjärnvätskan samlas in positivt med fördelarna med små provstorlekar, kontinuerlig provtagning och dynamisk observation12,13. När det gäller plats kan hjärnmikrodialyssonder selektivt implanteras i hjärnstrukturer eller kranialcisterner av intresse14. En observation av onormala nivåer av en endogen substans i hippocampus extracellulär vätska (HECF) föreslår förekomsten av CNS-sjukdomar eller patogenesen av sjukdom. Flera studier har visat att biomarkörerna för CNS-sjukdomar, såsom D-aminosyror vid schizofreni, β-amyloid- och tauproteiner vid Alzheimers sjukdom, neurofilamentlätta kedjor vid traumatisk hjärnskada och ubiquitinkarboxiterminalhydrolas L1s vid hypoxisk ischemiencefalopati, kan analyseras i cerebrospinalvätska15,16,17 . En kemisk analysmetod baserad på hjärnans mikrodialysprovtagningsteknik kan användas för att övervaka dynamiska förändringar av exogena föreningar, såsom aktiva ingredienser i etnomedicin, som diffunderar och distribueras i specifika hjärnregioner14.
Denna artikel presenterar den specifika processen för dynamisk HECF-förvärv hos vakna råttor och mäter dess osmotiska tryck för att säkerställa provkvalitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Patogenesen av CNS-sjukdomar är fortfarande inte helt förstådd, vilket hindrar utvecklingen av nya terapier och läkemedel. Studier har visat att de flesta CNS-sjukdomar är nära besläktade med hippocampus lesioner20,21,22. Den föreslagna hjärnmikrodialystekniken kan rikta in sig på specifika regioner i hjärnan, särskilt hippocampus, vilket gör att den sticker ut från det traditionella tillvägagångssättet att saml…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (82104533), Science & Technology Department of Sichuan Province (2021YJ0175) och China Postdoctoral Science Foundation (2020M683273). Författarna vill tacka Yuncheng Hong, senior utrustningsingenjör på Tri-Angels D&H Trading Pte. Ltd. (Singapore) för tillhandahållande av tekniska tjänster för mikrodialysteknik.
Materials
| Air-drying oven | Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd | GHG-9240A | |
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | Beijing leagene biotech. Co., Ltd | CZ0522 | |
| Brain microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Covance infusion harness | Instech Laboratories, Inc. | CIH95 | |
| Denture base resins | Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd | 190732 | |
| Electric cranial drill | Rayward Life Technology Co., Ltd | 78001 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd | H51021208 | |
| Iodophor | Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd | 202201 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Microdialysis catheter stylet | CMA Microdialysis AB | 8011205 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Osmometer | Löser | OM 807 | |
| Sodium hyaluronate eye drops | URSAPHARM Arzneimittel GmbH | H20150150 | |
| Stereotaxie apparatus | Rayward Life Technology Co., Ltd | 68025 | |
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Trypsin solution | Boster Biological Technology, Ltd. |
PYG0107 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
Referências
- Erkkinen, M. G., Kim, M. O., Geschwind, M. D. Clinical neurology and epidemiology of the major neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 033118 (2018).
- Salehi, A., Zhang, J. H., Obenaus, A. Response of the cerebral vasculature following traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2320-2339 (2017).
- Kurtzman, R. A. e. m. 3., Caruso, J. L. High-altitude illness death investigation. Academic Forensic Pathology. 8 (1), 83-97 (2018).
- Matsumoto, T., et al. Pharmacokinetic study of Ninjin’yoeito: Absorption and brain distribution of Ninjin’yoeito ingredients in mice. Journal of Ethnopharmacology. 279, 114332 (2021).
- Mahat, M. Y., et al. An improved method of transcutaneous cisterna magna puncture for cerebrospinal fluid sampling in rats. Journal of Neuroscience Methods. 211 (2), 272-279 (2012).
- Ceaglio, N., et al. High performance collection of cerebrospinal fluid in rats: evaluation of erythropoietin penetration after osmotic opening of the blood-brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 219 (1), 70-75 (2013).
- Bothwell, S. W., Janigro, D., Patabendige, A. Cerebrospinal fluid dynamics and intracranial pressure elevation in neurological diseases. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 9 (2019).
- Barthel, L., et al. A step-by-step guide for microsurgical collection of uncontaminated cerebrospinal fluid from rat cisterna magna. Journal of Neuroscience Methods. 352, 109085 (2021).
- Zhao, Y., Yang, Y., Wang, D. X., Wang, J., Gao, W. Y. Cerebrospinal fluid amino acid metabolite signatures of diabetic cognitive dysfunction based on targeted mass spectrometry. Journal of Alzheimer’s Disease. 86 (4), 1655-1665 (2022).
- Lim, N. K., et al. An improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice. Journal of Visualized Experiments. (133), e56774 (2018).
- Hendrickx, S., et al. A sensitive capillary LC-UV method for the simultaneous analysis of olanzapine, chlorpromazine and their FMO-mediated N-oxidation products in brain microdialysates. Talanta. 162, 268-277 (2017).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Current Protocols in Neuroscience. , (2009).
- Hammarlund-Udenaes, M. Microdialysis as an important technique in systems pharmacology-a historical and methodological review. The AAPS Journal. 19 (5), 1294-1303 (2017).
- Anderzhanova, E., Wotjak, C. T. Brain microdialysis and its applications in experimental neurochemistry. Cell and Tissue Research. 354 (1), 27-39 (2013).
- Mohammadi, A., Rashidi, E., Amooeian, V. G. Brain, blood, cerebrospinal fluid, and serum biomarkers in schizophrenia. Psychiatry Research. 265, 25-38 (2018).
- Lashley, T., et al. Molecular biomarkers of Alzheimer’s disease: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 11 (5), 031781 (2018).
- Kawata, K., Tierney, R., Langford, D. Blood and cerebrospinal fluid biomarkers. Handbook of Clinical Neurology. 158, 217-233 (2018).
- Zhao, Q. P., et al. Protective effects of dehydrocostuslactone on rat hippocampal slice injury induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation. International Journal of Molecular Medicine. 42 (2), 1190-1198 (2018).
- Wang, X. B. . Protective effects of dehydrocostuslactone on oxygen-glucose deprivation injury in rat hippocampal slices. , (2017).
- Coimbra-Costa, D., Alva, N., Duran, M., Carbonell, T., Rama, R. Oxidative stress and apoptosis after acute respiratory hypoxia and reoxygenation in rat brain. Redox Biology. 12, 216-225 (2017).
- Liu, H. Y., Chou, K. H., Chen, W. T. Migraine and the Hippocampus. Current Pain and Headache Reports. 22 (2), 13 (2018).
- Toda, T., Parylak, S. L., Linker, S. B., Gage, F. H. The role of adult hippocampal neurogenesis in brain health and disease. Molecular Psychiatry. 24 (1), 67-87 (2019).
- Wang, P., Lo Cascio, F., Gao, J., Kayed, R., Huang, X. F., F, X. Binding and neurotoxicity mitigation of toxic tau oligomers by synthetic heparin like oligosaccharides. Chemical Communications. 54 (72), 10120-10123 (2018).
- Han, J. Y., Li, Q., Ma, Z. Z., Fan, J. Y. Effects and mechanisms of compound Chinese medicine and major ingredients on microcirculatory dysfunction and organ injury induced by ischemia/reperfusion. Pharmacology & Therapeutics. 177, 146-173 (2017).
- Peng, T. M., et al. Anti-inflammatory effects of traditional Chinese medicines on preclinical in vivo models of brain ischemia-reperfusion-injury: Prospects for neuroprotective drug discovery and therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 204 (2019).
- König, M., Thinnes, A., Klein, J. Microdialysis and its use in behavioural studies: Focus on acetylcholine. Journal of Neuroscience Methods. 300, 206-215 (2018).
- Liu, M. Z., Wang, P., Yu, X. M., Dong, G. C., Yue, J. Intracerebral microdialysis coupled to LC-MS/MS for the determination tramadol and its major pharmacologically active metabolite O-desmethyltramadol in rat brain microdialysates. Drug Testing and Analysis. 9 (8), 1243-1250 (2017).
- de Lima Oliveira, M., et al. Cerebral microdialysis in traumatic brain injury and subarachnoid hemorrhage: state of the art. Neurocritical Care. 21 (1), 152-162 (2014).
- Amiridze, N., Dang, Y., Brown, O. R. Hydroxyl radicals detected via brain microdialysis in rats breathing air and during hyperbaric oxygen convulsions. Redox Report. 4 (4), 165-170 (1999).
- Chang, H. Y., Morrow, K., Bonacquisti, E., Zhang, W., Shah, D. K. Antibody pharmacokinetics in rat brain determined using microdialysis. MABS. 10 (6), 843-853 (2018).
- Wan, H. Y., et al. Pharmacokinetics of seven major active components of Mahuang decoction in rat blood and brain by LC-MS/MS coupled to microdialysis sampling. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 393 (8), 1559-1571 (2020).
- Zheng, H. Z., et al. Pharmacokinetic analysis of Huangqi Guizhi Wuwu decoction on blood and brain tissue in rats with normal and cerebral ischemia-reperfusion Injury by microdialysis with HPLC-MS/MS. Drug Design Development and Therapy. 14, 2877-2888 (2020).
- Bongaerts, J., et al. Sensitive targeted methods for brain metabolomic studies in microdialysis samples. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 161, 192-205 (2018).
- Zhang, Y. Q., Jiang, N., Yetisen, A. K. Brain neurochemical monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 189, 113351 (2021).
