JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

Bir Mikrodiyaliz Sistemi Kullanarak Bilinçli Sıçanlardan Hipokampal Hücre Dışı Sıvının Gerçek Zamanlı Dinamik Toplanması

Published: October 21, 2022
doi:
10.3791/64530
, , , , ,
1Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Buradaki protokol, bir mikrodiyaliz sistemi kullanarak uyanık sıçanların hipokampüsünden hücre dışı sıvının ayrıntılı bir gerçek zamanlı dinamik örneklemesini sağlar.

Abstract

Çeşitli merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıkları, hipokampal hücre dışı sıvının (HECF) bileşimindeki değişikliklerle ilişkilidir. Bununla birlikte, bilinçli sıçanlardan gerçek zamanlı olarak HECF elde etmedeki zorluk, CNS hastalığının ilerlemesinin değerlendirilmesini ve etnottıp tedavisinin etkinliğini uzun zamandır kısıtlamıştır. Cesaret verici bir şekilde, dinamik gözlem, kantitatif analiz ve küçük bir örnekleme boyutunun avantajları ile sürekli örnekleme için bir beyin mikrodiyaliz tekniği kullanılabilir. Bu, geleneksel bitkilerden ve canlı hayvanların beynindeki metabolitlerinden gelen bileşikler için hücre dışı sıvı içeriğindeki değişikliklerin izlenmesini sağlar. Bu nedenle bu çalışmanın amacı, Sprague Dawley (SD) sıçanlarının hipokampal bölgesine üç boyutlu bir beyin stereotaksik aparatı ile bir beyin omurilik sıvısı mikrodiyaliz probunu doğru bir şekilde implante etmek ve 20 kDa’dan büyük moleküler ağırlıkları kesmektir. Yüksek kaliteli HECF daha sonra bilinçli sıçanlardan, 2.87 nL / dak – 2.98 mL / dak arasında ayarlanabilir bir örnekleme hızına sahip bir mikrodiyaliz örnekleme kontrol sistemi kullanılarak elde edildi. Sonuç olarak, protokolümüz, CNS ile ilişkili hastalıkların patogenezini daha fazla araştırmak ve ilaç etkinliğini değerlendirmek için bize sınırsız olanaklar sağlayan mikrodiyaliz teknolojisinin yardımıyla uyanık sıçanlarda HECF elde etmek için etkili, hızlı ve dinamik bir yöntem sunmaktadır.

Introduction

Nörodejeneratif hastalık, travmatik beyin hasarı, yüksek irtifa hipoksisine bağlı beyin hasarı ve iskemik inme gibi yüksek morbiditeleri olan santral sinir sistemi (SSS) hastalıkları, dünya çapında artan mortalitenin önemli nedenleridir 1,2,3. Belirli beyin bölgelerindeki sitokinlerin ve protein değişikliklerinin gerçek zamanlı izlenmesi, CNS hastalıklarının ve ilaç tedavisinden sonra beyin farmakokinetik çalışmalarının tanısal doğruluğuna katkıda bulunur. Geleneksel bilimsel araştırmalar, belirli maddelerin tespiti ve farmakokinetik çalışmalar için beyin dokusu homojenatı veya hayvan interstisyel beyin sıvısının manuel olarak toplanmasını kullanır. Bununla birlikte, bunun sınırlı örneklem büyüklüğü, göstergelerdeki değişiklikleri dinamik olarak gözlemleyememe ve eşit olmayan örnekleme kalitesi 4,5,6 gibi bazı eksiklikleri vardır. Bir interstisyel sıvı olan beyin omurilik sıvısı, beyni ve omuriliği mekanik hasarlardan korur. Bileşimi, kan-beyin bariyerinin (BBB) varlığından dolayı serumunkinden farklıdır7. Beyin omurilik sıvısı örneklerinin doğrudan analizi, CNS lezyonlarının mekanizmasını ve ilaç keşfini ortaya çıkarmak için daha elverişlidir. Kaçınılmaz olarak, bir şırınga yoluyla doğrudan cisterna magna ve serebral ventriküllerden manuel olarak elde edilen beyin omurilik sıvısı örnekleri, kan kontaminasyonu, rastgele numune toplama şansı, miktar belirsizliği ve neredeyse hiç çoklu gerialma olasılığı 8,9’a sahip değildir. Daha da önemlisi, konvansiyonel interstisyel beyin sıvısı örnekleme yöntemleri, hasarlı beyin bölgelerinden örnekler elde edememekte, bu da spesifik beyin bölgelerinde CNS hastalıklarının patogenezinin araştırılmasını ve hedeflenen etnotilaç tedavilerinin etkinlik değerlendirmesini engellemektedir 9,10.

Beyin mikrodiyalizi, uyanık hayvanlarda interstisyel beyin sıvısını örneklemek için kullanılan bir tekniktir11. Mikrodiyaliz sistemi, beyne implante edilen bir prob yardımıyla vasküler geçirgenliği taklit eder. Mikrodiyaliz probu yarı geçirgen bir zarla donanmıştır ve belirli beyin bölgelerine implante edilir. İzotonik yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ile perfüzyondan sonra, diyalize interstisyel beyin sıvısı, küçük örneklem boyutları, sürekli örnekleme ve dinamik gözlem12,13 faydaları ile olumlu bir şekilde toplanabilir. Konum açısından, beyin mikrodiyaliz probları seçici olarak beyin yapılarına veya ilgilenilen kranial sarnıçlara implante edilebilir14. Hipokampal hücre dışı sıvıdaki (HECF) endojen bir maddenin anormal seviyelerinin gözlemlenmesi, CNS hastalıklarının oluşumunu veya hastalığın patogenezini düşündürmektedir. Birçok çalışma, şizofrenide D-amino asitler, Alzheimer hastalığında β-amiloid ve tau proteinleri, travmatik beyin hasarında nörofilament hafif zincirleri ve hipoksik iskemi ensefalopatisinde ubikitin karboksi-terminal hidrolaz L1’ler gibi CNS hastalıkları için biyobelirteçlerin beyin omurilik sıvısında analiz edilebileceğini göstermiştir15,16,17 . Beyin mikrodiyaliz örnekleme tekniğine dayanan bir kimyasal analiz yöntemi, belirli beyin bölgelerinde yayılan ve dağılan etnotilacın aktif bileşenleri gibi eksojen bileşiklerin dinamik değişikliklerini izlemek için kullanılabilir14.

Bu makale, uyanık sıçanlarda dinamik HECF ediniminin spesifik sürecini sunmakta ve numune kalitesini sağlamak için ozmotik basıncını ölçmektedir.

Protocol

Deneysel protokol, Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımı ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi’nin gerekliliklerine uygun olarak yürütülmüştür (Kayıt numarası: 2021-11). Bu çalışmada erkek Sprague Dawley (SD) sıçanları (280 ± 20 g, 6-8 haftalık) kullanıldı. 1. Beyin mikrodiyaliz probu implantasyon cerrahisi Sıçan anestezisinin indüksiyonu ve bakımı için sırasıyla% 3 ve% 1.5 izoflu…

Representative Results

Yukarıdaki deneysel protokol ve Tablo 1’de belirlenen örnekleme parametreleri takip edilerek, belirlenen örnekleme hızında su benzeri, renksiz ve şeffaf sıçan HECF elde edilmiştir (Şekil 1K). Elde edilen sıçan HECF’nin ozmotik basıncı 290-310 mOsm / L idi, bu da dolaylı olarak numunelerin kalitesini18,19 sağlayabilir. <img alt="Fig…

Discussion

SSS hastalıklarının patogenezi hala tam olarak anlaşılamamıştır, bu da yeni tedavilerin ve ilaçların geliştirilmesini engellemektedir. Çalışmalar, çoğu MSS hastalığının hipokampal lezyonlarla yakından ilişkili olduğunu göstermiştir20,21,22. Önerilen beyin mikrodiyaliz tekniği, beynin belirli bölgelerini, özellikle de hipokampüsü hedefleyebilir ve bu da onu geleneksel HECF toplama yaklaşımından a…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82104533), Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Bölümü (2021YJ0175) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2020M683273) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, Tri-Angels D&H Trading Pte’de kıdemli bir ekipman mühendisi olan Bay Yuncheng Hong’a teşekkür etmek istiyor. Ltd. (Singapur) mikrodiyaliz tekniği için teknik hizmetler sağladığı için.

Materials

 Air-drying oven Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd GHG-9240A
Animal anesthesia system Rayward Life Technology Co., Ltd R500IE
Animal temperature maintainer Rayward Life Technology Co., Ltd 69020
Artificial cerebrospinal fluid Beijing leagene biotech. Co., Ltd CZ0522
Brain microdialysis probe  CMA Microdialysis AB T56518
Catheter  CMA Microdialysis AB T56518
Covance infusion harness Instech Laboratories, Inc. CIH95
Denture base resins Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd 190732
Electric cranial drill Rayward Life Technology Co., Ltd 78001
Electric shaver Rayward Life Technology Co., Ltd CP-5200
Free movement tank for animals  CMA Microdialysis AB CMA120
Heparin sodium injection Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd H51021208
Iodophor Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd 202201
Isofluran Rayward Life Technology Co., Ltd R510-22
Microdialysis catheter stylet  CMA Microdialysis AB 8011205
Microdialysis collection tube  CMA Microdialysis AB 7431100
Microdialysis collector  CMA Microdialysis AB CMA4004
Microdialysis fep tubing  CMA Microdialysis AB 3409501
Microdialysis in vitro stand  CMA Microdialysis AB CMA130
Microdialysis microinjection pump  CMA Microdialysis AB 788130
Microdialysis syringe (1.0 mL)  CMA Microdialysis AB 8309020
Microdialysis tubing adapter  CMA Microdialysis AB 3409500
Non-absorbable surgical sutures Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd S19004
Ophthalmic forceps Rayward Life Technology Co., Ltd F12016-15
Osmometer Löser OM 807
Sodium hyaluronate eye drops URSAPHARM Arzneimittel GmbH H20150150
Stereotaxie apparatus Rayward Life Technology Co., Ltd 68025
Surgical scissors Rayward Life Technology Co., Ltd S14014-15
Surgical scissors Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd BY-103
Syringe needle  CMA Microdialysis AB T56518
Trypsin solution Boster
Biological Technology, Ltd.		 PYG0107
Ultrasonic cleaner Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd KMH1-240W8101
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Erkkinen, M. G., Kim, M. O., Geschwind, M. D. Clinical neurology and epidemiology of the major neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 033118 (2018).
  2. Salehi, A., Zhang, J. H., Obenaus, A. Response of the cerebral vasculature following traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2320-2339 (2017).
  3. Kurtzman, R. A. e. m. 3., Caruso, J. L. High-altitude illness death investigation. Academic Forensic Pathology. 8 (1), 83-97 (2018).
  4. Matsumoto, T., et al. Pharmacokinetic study of Ninjin’yoeito: Absorption and brain distribution of Ninjin’yoeito ingredients in mice. Journal of Ethnopharmacology. 279, 114332 (2021).
  5. Mahat, M. Y., et al. An improved method of transcutaneous cisterna magna puncture for cerebrospinal fluid sampling in rats. Journal of Neuroscience Methods. 211 (2), 272-279 (2012).
  6. Ceaglio, N., et al. High performance collection of cerebrospinal fluid in rats: evaluation of erythropoietin penetration after osmotic opening of the blood-brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 219 (1), 70-75 (2013).
  7. Bothwell, S. W., Janigro, D., Patabendige, A. Cerebrospinal fluid dynamics and intracranial pressure elevation in neurological diseases. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 9 (2019).
  8. Barthel, L., et al. A step-by-step guide for microsurgical collection of uncontaminated cerebrospinal fluid from rat cisterna magna. Journal of Neuroscience Methods. 352, 109085 (2021).
  9. Zhao, Y., Yang, Y., Wang, D. X., Wang, J., Gao, W. Y. Cerebrospinal fluid amino acid metabolite signatures of diabetic cognitive dysfunction based on targeted mass spectrometry. Journal of Alzheimer’s Disease. 86 (4), 1655-1665 (2022).
  10. Lim, N. K., et al. An improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice. Journal of Visualized Experiments. (133), e56774 (2018).
  11. Hendrickx, S., et al. A sensitive capillary LC-UV method for the simultaneous analysis of olanzapine, chlorpromazine and their FMO-mediated N-oxidation products in brain microdialysates. Talanta. 162, 268-277 (2017).
  12. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Current Protocols in Neuroscience. , (2009).
  13. Hammarlund-Udenaes, M. Microdialysis as an important technique in systems pharmacology-a historical and methodological review. The AAPS Journal. 19 (5), 1294-1303 (2017).
  14. Anderzhanova, E., Wotjak, C. T. Brain microdialysis and its applications in experimental neurochemistry. Cell and Tissue Research. 354 (1), 27-39 (2013).
  15. Mohammadi, A., Rashidi, E., Amooeian, V. G. Brain, blood, cerebrospinal fluid, and serum biomarkers in schizophrenia. Psychiatry Research. 265, 25-38 (2018).
  16. Lashley, T., et al. Molecular biomarkers of Alzheimer’s disease: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 11 (5), 031781 (2018).
  17. Kawata, K., Tierney, R., Langford, D. Blood and cerebrospinal fluid biomarkers. Handbook of Clinical Neurology. 158, 217-233 (2018).
  18. Zhao, Q. P., et al. Protective effects of dehydrocostuslactone on rat hippocampal slice injury induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation. International Journal of Molecular Medicine. 42 (2), 1190-1198 (2018).
  19. Wang, X. B. . Protective effects of dehydrocostuslactone on oxygen-glucose deprivation injury in rat hippocampal slices. , (2017).
  20. Coimbra-Costa, D., Alva, N., Duran, M., Carbonell, T., Rama, R. Oxidative stress and apoptosis after acute respiratory hypoxia and reoxygenation in rat brain. Redox Biology. 12, 216-225 (2017).
  21. Liu, H. Y., Chou, K. H., Chen, W. T. Migraine and the Hippocampus. Current Pain and Headache Reports. 22 (2), 13 (2018).
  22. Toda, T., Parylak, S. L., Linker, S. B., Gage, F. H. The role of adult hippocampal neurogenesis in brain health and disease. Molecular Psychiatry. 24 (1), 67-87 (2019).
  23. Wang, P., Lo Cascio, F., Gao, J., Kayed, R., Huang, X. F., F, X. Binding and neurotoxicity mitigation of toxic tau oligomers by synthetic heparin like oligosaccharides. Chemical Communications. 54 (72), 10120-10123 (2018).
  24. Han, J. Y., Li, Q., Ma, Z. Z., Fan, J. Y. Effects and mechanisms of compound Chinese medicine and major ingredients on microcirculatory dysfunction and organ injury induced by ischemia/reperfusion. Pharmacology & Therapeutics. 177, 146-173 (2017).
  25. Peng, T. M., et al. Anti-inflammatory effects of traditional Chinese medicines on preclinical in vivo models of brain ischemia-reperfusion-injury: Prospects for neuroprotective drug discovery and therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 204 (2019).
  26. König, M., Thinnes, A., Klein, J. Microdialysis and its use in behavioural studies: Focus on acetylcholine. Journal of Neuroscience Methods. 300, 206-215 (2018).
  27. Liu, M. Z., Wang, P., Yu, X. M., Dong, G. C., Yue, J. Intracerebral microdialysis coupled to LC-MS/MS for the determination tramadol and its major pharmacologically active metabolite O-desmethyltramadol in rat brain microdialysates. Drug Testing and Analysis. 9 (8), 1243-1250 (2017).
  28. de Lima Oliveira, M., et al. Cerebral microdialysis in traumatic brain injury and subarachnoid hemorrhage: state of the art. Neurocritical Care. 21 (1), 152-162 (2014).
  29. Amiridze, N., Dang, Y., Brown, O. R. Hydroxyl radicals detected via brain microdialysis in rats breathing air and during hyperbaric oxygen convulsions. Redox Report. 4 (4), 165-170 (1999).
  30. Chang, H. Y., Morrow, K., Bonacquisti, E., Zhang, W., Shah, D. K. Antibody pharmacokinetics in rat brain determined using microdialysis. MABS. 10 (6), 843-853 (2018).
  31. Wan, H. Y., et al. Pharmacokinetics of seven major active components of Mahuang decoction in rat blood and brain by LC-MS/MS coupled to microdialysis sampling. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 393 (8), 1559-1571 (2020).
  32. Zheng, H. Z., et al. Pharmacokinetic analysis of Huangqi Guizhi Wuwu decoction on blood and brain tissue in rats with normal and cerebral ischemia-reperfusion Injury by microdialysis with HPLC-MS/MS. Drug Design Development and Therapy. 14, 2877-2888 (2020).
  33. Bongaerts, J., et al. Sensitive targeted methods for brain metabolomic studies in microdialysis samples. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 161, 192-205 (2018).
  34. Zhang, Y. Q., Jiang, N., Yetisen, A. K. Brain neurochemical monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 189, 113351 (2021).

Tags

Hippocampal Extracellular FluidBrain MicrodialysisReal-time Dynamic CollectionConscious RatsCentral Nervous DiseasesStereotaxic Brain LocatorCranial DrillMicrodialysis CasingACSFMulti-channel Swivel ControllerMicrosyringe Pump
check_url/pt/64530?article_type=t&slug=real-time-dynamic-collection-hippocampal-extracellular-fluid-from

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Wang, X., Xie, N., Zhang, Y., Meng, X., Hou, Y., Zhang, S. Real-Time Dynamic Collection of Hippocampal Extracellular Fluid from Conscious Rats Using a Microdialysis System. J. Vis. Exp. (188), e64530, doi:10.3791/64530 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image