Este protocolo descreve uma metodologia para avaliar a função de canais iônicos ativados mecanicamente em células uroteliais nativas usando o sensor fluorescente Ca2+ GCaMP5G.
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Artigo de método
Ex Vivo Análise de Transientes de Ca2+ Ativados Mecanicamente em Células Uroteliais
Neste artigo
Resumo
Resumo
Canais iônicos ativados mecanicamente são transdutores biológicos que convertem estímulos mecânicos, como forças de estiramento ou cisalhamento, em sinais elétricos e bioquímicos. Em mamíferos, os canais ativados mecanicamente são essenciais para a detecção de estímulos externos e internos em processos tão diversos quanto a sensação de toque, audição, regulação do volume dos glóbulos vermelhos, regulação da pressão arterial basal e sensação de plenitude da bexiga urinária. Embora a função dos canais iônicos ativados mecanicamente tenha sido extensivamente estudada no cenário in vitro usando a técnica patch-pamp, avaliar sua função em seu ambiente nativo continua sendo uma tarefa difícil, muitas vezes devido ao acesso limitado aos locais de expressão desses canais (por exemplo, terminais aferentes, células de Merkel, barorreceptores e túbulos renais) ou dificuldades na aplicação da técnica patch-clamp (por exemplo, as superfícies apicais das células guarda-chuva uroteliais). Este protocolo descreve um procedimento para avaliar transientes de Ca 2+ evocados mecanicamente usando o sensor fluorescente GCaMP5G em uma preparação urotelial ex vivo, uma técnica que poderia ser prontamente adaptada para o estudo de eventos de Ca2+ evocados mecanicamente em outras preparações de tecidos nativos.
Introdução
As células epiteliais do trato urinário são submetidas a forças mecânicas à medida que o filtrado urinário viaja através dos néfrons, e a urina é bombeada para fora da pelve renal e viaja através dos ureteres para ser armazenada na bexiga urinária. Há muito se reconhece que as forças mecânicas (por exemplo, tensão de cisalhamento e estiramento) exercidas por fluidos nas células epiteliais que revestem o trato urinário regulam a reabsorção de proteínas no túbulo proximal e de solutos no néfron distal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11
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Protocolo
O cuidado e o manuseio dos animais foram realizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh. Camundongos C57Bl/6J fêmeas de 2-4 meses de idade foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais).
1. Montagem e configuração do equipamento
- Realize imagens Ca2+ com um microscópio vertical equipado com uma câmera de alta resolução e uma fonte de luz estável (consulte Tabela de materiais).
- Adquira as imagens com um software compatível com microscópio que ....
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Resultados
O presente protocolo descreve uma técnica para avaliar transientes de Ca 2+ evocados mecanicamente em células guarda-chuva usando o sensor fluorescente de Ca2+ GCaMP5G. A transdução adenoviral foi empregada para expressar GCaMP5G em células uroteliais devido à sua alta eficiência e por produzir um nível elevado de expressão. Imagens fluorescentes de criosecções coradas de uma bexiga transduzida são mostradas na Figura 2D. Para esses experimentos, a expressão de GCaMP5G .......
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Discussão
Todos os organismos, e aparentemente a maioria dos tipos celulares, expressam canais iônicos que respondem a estímulos mecânicos 20,33,34,35,36,37. A função desses canais ativados mecanicamente tem sido predominantemente avaliada com a técnica patch-praçad. No entanto, devido a problemas de acessibilidade, os estudos patch-cl.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do NIH R01DK119183 (para G.A. e MDC) e S10OD028596 (para G.A.) e pelo Cell Physiology and Model Organism Kidney Imaging Cores do Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 20x Objetiva | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾ ” cateter | Medline | Lâmina Suresite IV | |
| 4x Objetiva | Olympus | UPlanFL N | |
| Conversor analógico/digital | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP anticorpo | Abcam | Ab6556 | |
| Divisor de feixe | Chroma | T495lpxr | |
| Controlador de temperatura bipolar | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M |
| solução cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS câmera | Hamamatsu | ORCA fusão | |
| Donkey anti-coelho conjugado com Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filtro | Croma | ET470/40X | |
| Capilares de vidro Corning 8250 vidro | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glicose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Aquecedor | H4034 | |
| Warner Instruments | SH-27B | ||
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Fonte de luz | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Tubulação da bomba do coletor | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Tubulação da bomba do coletor | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mouses | Jackson Lab | 664 | 2-4 meses de idade fêmea C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | Micromanipulador MF-830 | |
| Sutter Instruments | MP-285 | ||
| Microscópio | Olympus | BX51W | |
| Montagem de mídia com DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade com DAPI |
| NaCl | Software Sigma | S7653 | |
| pClamp | Molecular Devices | Versão 10.4 | Software de aquisição e análise de dados de eletrofisiologia Patch-clamp |
| Bomba peristáltica | Gilson | Minipuls 3 | |
| Atuador piezoelétrico | Thorlabs | PAS005 | |
| Suporte de pipeta | World Precision Instruments | ||
| Extrator de pipetas | Narishige | PP-830 | |
| Base aquecida de troca rápida com perfusão e kit de anel adaptador | Plataforma de troca rápida Warner Instruments | QE-1 | se encaixa em prato de 35 mm |
| Rodamina-faloidina | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Versão 14.0 | Software de análise de dados e gráficos científicos |
| Elastômero de silicone | Dow | Sylgard 184 | |
| Controlador piezo de circuito aberto de canal único | Thorlabs | MDT694B | |
| Almofada quadrada de suporte de grade | Ted Pella | 10520 | |
| Sutura | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Haste de |
| montagem de Teflon | Feito sob medida | Use para montar o atuador piezoelétrico no micromanipulador | |
| Tubulação | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| Dispositivo de E/S Digital USB | National Instruments | NI USB-6501 |
Referências
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C.
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Reimpressões e permissões
