Autofluorescensbilleddannelse til evaluering af rødalgerfysiologi

Summary

Denne protokol beskriver trin-for-trin autofluorescensbilleddannelse og evaluering af fykobiliproteinændringer i rødalger baseret på spektralanalyse. Dette er en etiketfri og ikke-destruktiv metode til evaluering af cellulær tilpasning til ekstreme levesteder, når kun knappe materialer er tilgængelige, og celler vokser langsomt eller slet ikke under laboratorieforhold.

Abstract

Rødalger (Rhodophyta) indeholder phycobiliproteiner og koloniserer levesteder med svagt lys, men nogle (f.eks. Nogle Chroothece-arter ) kan også udvikle sig i fuld solskin. De fleste rhodophytes er røde, men nogle kan forekomme blålige, afhængigt af andelen af blå og røde biliproteiner (phycocyanin og phycoerythrin). Forskellige phycobiliproteiner kan fange lys ved forskellige bølgelængder og overføre det til klorofyl a, hvilket gør fotosyntese under meget forskellige lysforhold mulige. Disse pigmenter reagerer på habitatændringer i lys, og deres autofluorescens kan hjælpe med at studere biologiske processer. Ved hjælp af Chroothece mobilis som modelorganisme og spektral lambdascanningstilstand i et konfokalmikroskop blev tilpasningen af fotosyntetiske pigmenter til forskellige monokromatiske lys undersøgt på celleniveau for at gætte artens optimale vækstbetingelser. Resultaterne viste, at selv når den undersøgte stamme blev isoleret fra en hule, tilpassede den sig både svage og mellemstore lysintensiteter. Den præsenterede metode er især nyttig til at studere fotosyntetiske organismer, der ikke vokser eller vokser meget langsomt under laboratorieforhold, hvilket normalt er tilfældet for dem, der lever i ekstreme levesteder.

Introduction

Rødalger, såsom slægten Chroothece, kan vokse i ekstreme levesteder, hvor de ofte skal klare markante miljøændringer¹. Oversvømmelser og tørke er hyppige i halvtørre områder, hvor denne slægt kan findes, og nogle arter er blevet rapporteret i åer, klipper, huler eller endda termiske farvande². Men det meste af tiden henviser biologiske variabler, såsom konkurrence eller græsning, arter til ikke-optimale betingelser for deres vækst. Da disse organismer ofte er vanskelige at dyrke og enten ikke vokser eller vokser meget langsomt under laboratorieforhold, er en væsentlig begrænsning den tilgængelige prøvestørrelse. Derfor er det meget vigtigt at følge ikke-destruktive metoder eller metoder, der involverer minimal prøvemanipulation ^3,4.

De fysiologiske færdigheder, der er nødvendige for at overleve i disse barske miljøer, kan overvåges ved at følge ændringer i deres fotosyntetiske systemer. Metaboliske mekanismer, fotosyntetisk effektivitet og følsomhed over for lys- eller kulturbetingelser kan afsløres ved pigmentfluorescensemissionsprofiler på grund af nøjagtige ændringer i deres energioverførsel eller fangst 5,6,7,8.

Autofluorescens af cellulære forbindelser kan anvendes som markør for cytodiagnose eller som en naturlig indikator for cellulær tilstand eller metabolisme som reaktion på eksterne og interne signaler gennem ændringer i emission⁹. Det kan også bruges til at skelne taksonomisk forskellige grupper af fotosyntetiske organismer¹⁰. Afhængigt af den fylogenetiske position af fototrofe mikroorganismer kan man finde forskellige in vivo fluorescensegenskaber. Derfor er en taksonomisk identifikation baseret på in vivo-karakteristika for fototrofisk fluorescens (herunder fluorescensabsorption og emissionsspektre) blevet forsøgt ved flere lejligheder^11,12. På grund af mangfoldigheden i tilbehørspigmenter blandt fytoplanktontaxa kan forskelle i bølgelængderne, ved hvilke klorofyl a (Chl a) fluorescens stimuleres, eller forskelle i emissionsspektre anvendes til at udlede taksonomi¹³. In vivo fluorescensexcitations- og emissionsspektrene for disse prøver er ikke kun afhængige af algernes phyla, men også af fotosystemtilpasning¹⁴. Effektiviteten af energioverførsel til Chl a eller forholdet mellem Chl a og tilbehørspigmenter og det cellulære pigmentindhold er følsomme over for vækstbetingelser⁵.

Rødalger, især Chroothece, har flere tilbehør fluorescerende pigmenter-phycobiliproteiner og carotenoider; Det førstnævnte koncentrat i phycobilisomer bundet til thylakoiderne af kloroplaster. Phycobiliproteiner (phycocyanin, phycoerythrin, og allophycocyanin) kan fange lys ved forskellige bølgelængder og overføre det til Chl a, hvilket gør fotosyntese i meget forskellige lys- og kulturforhold mulig¹⁵. For eksempel kan Chroothece-arter vokse inde i huler eller næsten dukke op i let saltholdige kalkholdige vandløb².

Monokromatiske lys påvirker væksten og pigmentsammensætningen af fotosyntetiske organismer og er blevet undersøgt for at forhindre eller kontrollere væksten af fotosyntetiske organismer i huler. Mulec et al. viste, at rød beriget belysning fremmer væksten af cyanobakterier, alger og planter¹⁶. Tidligere undersøgelser har også rapporteret, at grønt lys påvirker pigmentsammensætningen af cyanobakterier¹⁷, mens andre har afsløret, at grønt lys forhindrer væksten af de fleste fotosyntetiske organismer, og nogle cyanobakterier udviser en reduktion i thylakoider og svagere gennemsnitlig fluorescensintensitet¹⁸.

For at forstå Chrootheces evne som modelorganisme til at overvinde barske forhold er dyrkede celler blevet udsat for stigende lysintensiteter og monokromatisk lys (grønt eller rødt)¹⁵ for at se, hvordan det håndterer de svage forhold i huler (hvor rødt lys dominerer). Protokollen præsenteret heri reproducerer effekten af ovennævnte variabler på Chroothece’s phycobiliproteiner på celleniveau ved hjælp af sin egen autofluorescens.

I dag bruges fluorescens almindeligvis som et værktøj til at studere de fysiologiske reaktioner hos vaskulære planter, mikroalger, makroalger og cyanobakterier^13,14,16. Spektral konfokal fluorescensmikroskopi er et fremragende værktøj til in vivo-undersøgelser til evaluering af fotosyntetiske prøvers fysiologi på enkeltcelleniveau 10,17,18,19,20 ved at undgå problemer forbundet med den lave væksthastighed i laboratoriet og vanskelighederne med at opnå tilstrækkelig biomasse til de tilknyttede ekstraktions- og biokemiske metoder ⁸ . Når cellerne er behandlet under forskellige dyrkningsbetingelser i 2 uger, kan lambdascanningsprofilen måles in vivo. Selv om der er flere publikationer, hvor forskellige bølgelængder af excitation ved konfokal billeddannelse er blevet anvendt 3,4,10,17, kan de fleste phycobiliproteiner og Chl a detekteres ved hjælp af en 561 nm bølgelængde excitationslinje^, og den detekterede emission varierer fra 570 til ⁷⁶⁰ nm bølgelængde. Disse kriterier er baseret på en analyse, der tidligere er udført 10 med kommercielle rene pigmenter (tabel 1) ved konfokal billeddannelse og de opnåede resultater i forskellige algeart^20,21,22.

Pigmenter	λflmax (nm)	λ exc (nm)
		351	364	458	476	488	514	543	633
Chl a	660.9-678.1	43,4 ± 1,8	11,2 ± 0,2	1.8 ± 0.05	2,0 ± 0,08	12,2 ± 0,7	6,0 ± 0,3	4.2 ± 0.16	80,7 ± 1,5
R-PE	569.2-583.3	5.9 ± 0.6	5.9 ± 0.16	11,1 ± 0,04	42,2 ± 0,3	100,0 ± 0	90,0 ± 0,3	99,2 ± 0,08	–
	652.1-668.6	–	–	1,5 ± 0,01	3.7 ± 0.04	26,7 ± 0,5	8,7 ± 0,16	11.1 ± 0.16	11.3 ± 0.2
C-PC	636.2-676.4	2.3 ± 0.04	1,0 ± 0,01	0,6 ± 0,004	0.7 ± 0.008	2,0 ± 0,08	2,0 ± 0,04	3.3 ± 0.16	33,6 ± 0,9
APC-XL	667.3-683.8	15.1 ± 1.5	9,6 ± 0,98	1,0 ± 0,04	1.2 ± 0.08	5.9 ± 0.7	4.1 ± 0.5	23.2 ± 3.5	91,4 ± 2,3

Tabel 1: De rene pigmentoplysninger, der bruges til at køre lambdascanningsanalysen. Denne tabel viser emissionstoppe og skuldre/fluorescensbåndmaksima for forskellige fluorkromer/pigmenter ved konfokal billedspektrofotometri for alle excitationsbølgelængder og procentdelen af lysemission fra pigmenter/fluorkromer. Værdierne blev beregnet ved hjælp af formlen: = MFI*100/255. Hver værdi er middelværdien ± SE (middelværdi ± standardfejl fra middelværdien). Rene pigmenter blev anvendt til kalibrering af det konfokale scanningslasermikroskop som følger: ^1,2,10. Klorofyl a blev opnået fra Spinacia oleracea, R-phycoerythrin (R-PE) fra Porphyra tenera og C-phycocyanin (C-PE) fra Spirulina sp. Alle arterne blev opløst i filtreret destilleret vand. Allophycocyanin-XL (APC-XL) blev opnået fra Mastigocladus laminosus, som blev opløst i ammoniumsulfat (60%) og kaliumphosphat (pH = 7) for at opnå en koncentration på 38 mM. Scanningerne blev udført med 400 μL af hver pigmentopløsning (koncentration på 1 mg/ml) ved hjælp af et 8-brønds dækket glasbundkammer.

Undersøgelsen af en enkelt excitationsbølgelængde er en ganske nyttig første tilnærmelse. I dette tilfælde er det imidlertid nødvendigt at belyse det relative bidrag fra de forskellige komplekser i fluorescenssignalet, hvilket anbefales at udføre et fluorescensforhold eller spektrumanalyse ved flere bølgelængder blandt andre metoder.

Protocol

Algearten Chroothece mobilis blev anvendt til denne undersøgelse. Arten blev opnået fra Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29 kultursamling. En oversigt over protokollen er vist i figur 1. Figur 1: Oversigt over undersøgelsen. Chroothece mobilis inkuberes under ekstrem…

Representative Results

Klorofyl a absorberer generelt blå og røde bølgelængder af synligt lys, mens phycobiliproteiner bruger grønne, gule og orange bølgelængder7. Autofluorescensen af disse pigmenter gør den første tilgang til at studere phycobiliproteiner og klorofyladfærd under eksperimentelle og feltbetingelser mulig. Ved at sammenligne de opnåede data og plotte på forskellige grafer kan der skelnes mellem signifikante ændringer i gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) (<s…

Discussion

Nogle encellede eller koloniale rødalger, såsom Chroothece, vokser langsomt in vitro, men indeholder flere autofluorescerende forbindelser, der kan analyseres ved spektralanalyse under et konfokalmikroskop, hvor forskelle i pigmentemissionstoppe kan detekteres. Spektral konfokal fluorescensmikroskopi har gjort det muligt for os at gennemføre in vivo-undersøgelser for at evaluere tilpasningen eller akklimatiseringen af fotosyntetiske organismer 8,10,17,18,19,20.^<…

Materials

µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom	Ibidi	81158	–
24 black well plate	Ibidi	82406	flat and clear bottom for high throughput microscopy
Algae Incubator	Panasonic	MLR-352-PE
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	SP8 TCS	–
Flask	Fisher Scientific	15380591	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
green filter	PNTA, LEE filters	–	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2	Leica Microsystems	506353	Glycerol immersion lens
Image acquisition software. LAS X	Leica Microsystems	SP8 TCS	–
Light source	Panasonic	FL40SSENW/37MLR-352-PE
Quantum photoradiometer	DeltaOhm	DO 9721	–
R software	R Core Team, 2020	4.0.2.	–
red filter	PNTA, LEE filters	–	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
SWES medium	University of Murcia	–	–
Type G Immersion liquid	Leica Microsystems	11513910	Glycerol