लाल शैवाल फिजियोलॉजी का मूल्यांकन करने के लिए ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल चरण-दर-चरण ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग और वर्णक्रमीय विश्लेषण के आधार पर लाल शैवाल में फाइकोबिलिप्रोटीन परिवर्तनों के मूल्यांकन का वर्णन करता है। यह चरम आवासों के लिए सेलुलर अनुकूलन का मूल्यांकन करने के लिए एक लेबल-मुक्त और गैर-विनाशकारी विधि है, जब केवल दुर्लभ सामग्री उपलब्ध होती है और प्रयोगशाला स्थितियों के तहत कोशिकाएं धीरे-धीरे बढ़ती हैं, या बिल्कुल नहीं।
Abstract
लाल शैवाल (रोडोफाइटा) में फाइकोबिलीप्रोटीन होते हैं और मंद प्रकाश के साथ आवासों को उपनिवेशित करते हैं, हालांकि कुछ (जैसे, कुछ क्रोथेस प्रजातियां) पूर्ण धूप में भी विकसित हो सकते हैं। अधिकांश रोडोफाइट्स लाल होते हैं, हालांकि कुछ नीले और लाल बिलीप्रोटीन (फाइकोसायनिन और फाइकोएरिथ्रिन) के अनुपात के आधार पर नीले दिखाई दे सकते हैं। विभिन्न फाइकोबिलीप्रोटीन विभिन्न तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश को पकड़ सकते हैं और इसे क्लोरोफिल ए तक पहुंचा सकते हैं, जो बहुत अलग प्रकाश परिस्थितियों में प्रकाश संश्लेषण को संभव बनाता है। ये पिगमेंट प्रकाश में निवास स्थान में परिवर्तन का जवाब देते हैं, और उनके ऑटोफ्लोरेसेंस जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में मदद कर सकते हैं। एक मॉडल जीव के रूप में क्रोमोथेस मोबिलाइजेशन और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में वर्णक्रमीय लैम्ब्डा स्कैन मोड का उपयोग करते हुए, प्रजातियों की इष्टतम विकास स्थितियों का अनुमान लगाने के लिए सेलुलर स्तर पर विभिन्न मोनोक्रोमैटिक रोशनी के लिए प्रकाश संश्लेषक वर्णक के अनुकूलन का अध्ययन किया गया था। परिणामों से पता चला है कि, यहां तक कि जब अध्ययन किए गए तनाव को एक गुफा से अलग किया गया था, तब भी यह मंद और मध्यम प्रकाश तीव्रता दोनों के अनुकूल था। प्रस्तुत विधि विशेष रूप से प्रकाश संश्लेषक जीवों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है जो प्रयोगशाला स्थितियों के तहत बहुत धीरे-धीरे नहीं बढ़ते हैं या बढ़ते हैं, जो आमतौर पर चरम आवासों में रहने वालों के लिए मामला है।
Introduction
लाल शैवाल, जैसे जीनस क्रोथेस, चरम आवासों में बढ़ सकते हैं, जहां उन्हें अक्सर चिह्नित पर्यावरणीयपरिवर्तनों का सामना करना पड़ता है। अर्ध-शुष्क क्षेत्रों में बाढ़ और सूखा अक्सर होता है जहां यह जीनस पाया जा सकता है, और कुछ प्रजातियों को खाड़ियों, चट्टानों, गुफाओं या यहां तक किथर्मल पानी में भी रिपोर्ट किया गया है। हालांकि, ज्यादातर समय, जैविक चर, जैसे कि प्रतिस्पर्धा या चराई, प्रजातियों को उनके विकास के लिए गैर-इष्टतम परिस्थितियों में ले जाते हैं। चूंकि इन जीवों को अक्सर संस्कृति करना मुश्किल होता है और या तो प्रयोगशाला स्थितियों के तहत बहुत धीरे-धीरे नहीं बढ़ते हैं या बढ़ते हैं, एक प्रमुख सीमा उपलब्ध नमूना आकार है। इसलिए, गैर-विनाशकारी तरीकों या विधियों का पालन करना बहुत महत्वपूर्ण है जिसमें न्यूनतम नमूना हेरफेर 3,4 शामिल है।
इन कठोर वातावरणों में जीवित रहने के लिए आवश्यक शारीरिक कौशल की निगरानी उनके प्रकाश संश्लेषक प्रणालियों में परिवर्तन का पालन करके की जा सकती है। मेटाबोलिक तंत्र, प्रकाश संश्लेषक दक्षता, और प्रकाश या संस्कृति स्थितियों के प्रति संवेदनशीलता को वर्णक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन प्रोफाइल द्वारा प्रकट किया जा सकता है, उनके ऊर्जा हस्तांतरण में सटीक परिवर्तन या 5,6,7,8 को फंसाने के कारण।
सेलुलर यौगिकों के ऑटोफ्लोरेसेंस का उपयोग साइटोडायग्नोसिस के लिए मार्कर के रूप में या उत्सर्जन में परिवर्तन के माध्यम से बाहरी और आंतरिक संकेतों के जवाब में सेलुलर स्थिति या चयापचय के प्राकृतिक संकेतक के रूप में किया जासकता है। इसका उपयोग प्रकाश संश्लेषक जीवों के विभिन्न समूहों को वर्गीकृत रूप से भेदभाव करने के लिए भी किया जासकता है। फोटोट्रोफिक सूक्ष्मजीवों की फाइटोलैनेटिक स्थिति के आधार पर, कोई विवो फ्लोरेसेंस विशेषताओं में अलग-अलग पा सकता है। इसलिए, फोटोट्रोफिक फ्लोरेसेंस (फ्लोरेसेंस अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा सहित) की इनविवो विशेषताओं के आधार पर एक टैक्सोनोमिक पहचान का प्रयास कई अवसरों परकिया गया है। फाइटोप्लांकटन टैक्सा के बीच सहायक पिगमेंट में विविधता के कारण, तरंग दैर्ध्य में अंतर जिस पर क्लोरोफिल ए (सीएचएल ए) प्रतिदीप्ति उत्तेजित होती है, या उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में अंतर, टैक्सोनॉमी13 का अनुमान लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इन नमूनों के विवो फ्लोरेसेंस उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा न केवल शैवाल के फ़ाइला पर निर्भर करते हैं, बल्कि फोटोसिस्टम अनुकूलन14 पर भी निर्भर करते हैं। सीएचएल ए में ऊर्जा हस्तांतरण की दक्षता, या सहायक वर्णक के लिए सीएचएल ए का अनुपात, और सेलुलर वर्णक सामग्रीविकास की स्थिति के प्रति संवेदनशील हैं।
लाल शैवाल, विशेष रूप से क्रोथेस, में कई सहायक फ्लोरोसेंट पिगमेंट-फाइकोबिलीप्रोटीन और कैरोटीनॉयड होते हैं; पूर्व क्लोरोप्लास्ट के थायलाकोइड्स से जुड़े फाइकोबिलिसोम में केंद्रित है। फाइकोबिलीप्रोटीन (फाइकोसायनिन, फाइकोएरिथ्रिन, और एलोफीकोसायनिन) विभिन्न तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश को पकड़ सकते हैं और इसे सीएचएल ए में प्रसारित कर सकते हैं, जो प्रकाश संश्लेषण को बहुत अलग प्रकाश और संस्कृति स्थितियोंमें संभव बनाता है। उदाहरण के लिए, क्रोथेस प्रजातियां गुफाओं के अंदर बढ़ सकती हैं या लगभग थोड़ी लवणीय कैल्केरसधाराओं में उभर सकती हैं।
मोनोक्रोमैटिक रोशनी प्रकाश संश्लेषक जीवों के विकास और वर्णक संरचना को प्रभावित करती है, और गुफाओं में प्रकाश संश्लेषक जीवों के विकास को रोकने या नियंत्रित करने के लिए अध्ययन किया गया है। मुलेक एट अल ने दिखाया कि लाल समृद्ध प्रकाश सायनोबैक्टीरिया, शैवाल और पौधों के विकास को बढ़ावा देताहै। पिछले अध्ययनों ने यह भी बताया है कि हरी रोशनी साइनोबैक्टीरिया17 की वर्णक संरचना को प्रभावित करती है, जबकि अन्य ने खुलासा किया है कि हरी रोशनी अधिकांश प्रकाश संश्लेषक जीवों के विकास को रोकती है और कुछ साइनोबैक्टीरिया थायलाकोइड्स में कमी और कमजोर औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता18 प्रदर्शित करते हैं।
कठोर परिस्थितियों को दूर करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में क्रोथेस की क्षमता को समझने के लिए, सुसंस्कृत कोशिकाओं को बढ़ती प्रकाश तीव्रता और मोनोक्रोमैटिक प्रकाश (हरा या लाल) 15 के संपर्क में लाया गया है, यह देखने के लिए कि यह गुफाओं की मंद परिस्थितियों (जहां लाल प्रकाश प्रबल है) के साथ कैसे सामना करता है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल अपने स्वयं के ऑटोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके सेलुलर स्तर पर क्रोमोथेस के फाइकोबिलिप्रोटीन पर उपर्युक्त चर के प्रभाव को पुन: उत्पन्न करता है।
आजकल, फ्लोरेसेंस का उपयोग आमतौर पर संवहनी पौधों, सूक्ष्म शैवाल, मैक्रोएल्गी और साइनोबैक्टीरिया 13,14,16 की शारीरिक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया जाता है। स्पेक्ट्रल कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी एकल-कोशिका स्तर 10,17,18,19,20 पर प्रकाश संश्लेषक नमूनों के शरीर विज्ञान का मूल्यांकन करने के लिए विवो अध्ययनों में एक शानदार उपकरण है, प्रयोगशाला में कम विकास दर से जुड़ी समस्याओं से बचकर और संबंधित निष्कर्षण और जैव रासायनिक विधियों के लिए पर्याप्त बायोमास प्राप्त करने में कठिनाइयों से बचकर। . एक बार जब कोशिकाओं को 2 सप्ताह के लिए विभिन्न संस्कृति स्थितियों के तहत इलाज किया जाता है, तो लैम्ब्डा स्कैन प्रोफाइल को विवो में मापा जा सकता है। यद्यपि ऐसे कई प्रकाशन हैं जिनमें कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा उत्तेजना के विभिन्न तरंग दैर्ध्य का उपयोग 3,4,10,17 किया गया है, अधिकांश फाइकोबिलीप्रोटीन और सीएचएल ए का पता 561 एनएम तरंग दैर्ध्य उत्तेजना लाइन का उपयोग करके लगाया जा सकता है, और पता लगाया गया उत्सर्जन 570 से 760 एनएम तरंग दैर्ध्य तक होता है। ये मानदंड पहले वाणिज्यिक शुद्ध पिगमेंट (तालिका 1) के साथ किए गए विश्लेषण पर आधारित हैं, जो कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा किए गए थे और विभिन्न शैवाल प्रजातियों20,21,22 में प्राप्त परिणाम थे।
| पिगमेंट | λflअधिकतम (nm) | λ exc (nm) | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| Chl a | 660.9-678.1 | 43.4 ± 1.8 | 11.2 ± 0.2 | 1.8 ± 0.05 | 2.0 ± 0.08 | 12.2 ± 0.7 | 6.0 ± 0.3 | 4.2 ± 0.16 | 80.7 ± 1.5 |
| R-PE | 569.2-583.3 | 5.9 ± 0.6 | 5.9 ± 0.16 | 11.1 ± 0.04 | 42.2 ± 0.3 | 100.0 ± 0 | 90.0 ± 0.3 | 99.2 ± 0.08 | – |
| 652.1-668.6 | – | – | 1.5 ± 0.01 | 3.7 ± 0.04 | 26.7 ± 0.5 | 8.7 ± 0.16 | 11.1 ± 0.16 | 11.3 ± 0.2 | |
| C-PC | 636.2-676.4 | 2.3 ± 0.04 | 1.0 ± 0.01 | 0.6 ± 0.004 | 0.7 ± 0.008 | 2.0 ± 0.08 | 2.0 ± 0.04 | 3.3 ± 0.16 | 33.6 ± 0.9 |
| APC-XL | 667.3-683.8 | 15.1 ± 1.5 | 9.6 ± 0.98 | 1.0 ± 0.04 | 1.2 ± 0.08 | 5.9 ± 0.7 | 4.1 ± 0.5 | 23.2 ± 3.5 | 91.4 ± 2.3 |
तालिका 1: लैम्ब्डा स्कैन विश्लेषण चलाने के लिए उपयोग की जाने वाली शुद्ध वर्णक जानकारी। यह तालिका सभी उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए कॉन्फोकल इमेजिंग स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा विभिन्न फ्लोरोक्रोम / पिगमेंट के उत्सर्जन चोटियों और कंधों / फ्लोरेसेंस बैंड मैक्सिमा को दर्शाती है, और पिगमेंट / फ्लोरोक्रोम द्वारा प्रकाश उत्सर्जन का प्रतिशत। मानों की गणना सूत्र द्वारा की गई थी: = एमएफआई * 100/255। प्रत्येक मान एसई ± माध्य है (माध्य से औसत ± मानक त्रुटि)। शुद्ध पिगमेंट का उपयोग कॉन्फोकल स्कैनिंग लेजर माइक्रोस्कोप को कैलिब्रेट करने के लिए किया गया था, जो निम्नानुसार 1,2,10 था। क्लोरोफिल ए को स्पिनेशिया ओलेरेसिया से, आर-फाइकोएरिथ्रिन (आर-पीई) को पोर्फिरी टेनेरा से और सी-फाइकोसायनिन (सी-पीई) को स्पिरुलिना एसपी से प्राप्त किया गया था। सभी प्रजातियों को फ़िल्टर किए गए आसुत जल में भंग कर दिया गया था। एलोफिकोसायनिन-एक्सएल (एपीसी-एक्सएल) को मास्टिगोक्लेडस लैमिनोसस से प्राप्त किया गया था, जिसे 38 एमएम की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए अमोनियम सल्फेट (60%) और पोटेशियम फॉस्फेट (पीएच = 7) में भंग कर दिया गया था। स्कैन 8-अच्छी तरह से कवर किए गए ग्लास बॉटम चैंबर का उपयोग करके प्रत्येक वर्णक समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता) के 400 μL के साथ किया गया था।
एकल उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का अध्ययन काफी उपयोगी पहला अनुमान है। इस मामले में, हालांकि, प्रतिदीप्ति संकेत में विभिन्न परिसरों के सापेक्ष योगदान को स्पष्ट करना आवश्यक है, जिसे अन्य तरीकों के बीच कई तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्ति अनुपात या स्पेक्ट्रम विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कुछ एककोशिकीय या औपनिवेशिक लाल शैवाल, जैसे कि क्रोमोथेस, विट्रो में धीरे-धीरे बढ़ते हैं, लेकिन इसमें कई ऑटोफ्लोरोसेंट यौगिक होते हैं जिनका विश्लेषण एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत वर्णक्रमीय ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह शोध परियोजनाओं टिन 2015-68454-आर और 20961/पीआई/18 के हिस्से के रूप में किया गया था, जिसे स्पेनिश अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धा मंत्रालय और मर्सिया क्षेत्र के सेनेका फाउंडेशन द्वारा वित्तपोषित किया गया था। मर्सिया विश्वविद्यालय के वैज्ञानिक और अनुसंधान क्षेत्र के सांख्यिकीय सहायता अनुभाग से आइरीन हर्नांडेज़ मार्टिनेज और फ्रांसिस्को जेवियर इबानेज़ लोपेज़ (सेकिओन डी एपोयो एस्टाडिस्टिको (एसएई), एरिया साइंटिफिका वाई डी इन्वेस्टिगासियोन (एसीटीआई), यूनिवर्सिड डी मर्सिया, (चित्रा 1 सर्वियर मेडिकल आर्ट से चित्रों का उपयोग करके तैयार किया गया था)। सर्वियर द्वारा सर्वियर मेडिकल आर्ट को क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन 3.0 अनपोर्टेड लाइसेंस (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/) के साथ लाइसेंस प्राप्त है
Materials
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | – |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | – |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | – |
| red filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | – | – |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
Referências
- Vis, M. L., Necchi, O. . Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , (2021).
- Aboal, M., et al. Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species. European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).
- Millach, L., Obiol, A., Solé, A., Esteve, I. A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser. Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).
- Millach, L., Villagrasa, E., Solé, A., Esteve, I. Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress. Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).
- Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence. Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , (2000).
- Beutler, M., et al. A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ. Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).
- Grigoryeva, N., Chistyakova, L. Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures. Cyanobacteria. , (2018).
- Grigoryeva, N. . Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).
- Roldán, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hernández-Mariné, M. Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry. Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).
- Hense, B. A., Gais, P., Jütting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis. Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).
- Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae. European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).
- Richardson, T. L., et al. Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser. Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).
- Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).
- Coronado-Parra, T., Roldán, M., Aboal, M. Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae. Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).
- Mulec, J., Kosi, G. Lampenflora algae and methods of growth control. Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).
- Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis. Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).
- Roldán, M., Oliva, F., Gónzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hernández-Mariné, M. Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).
- Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures. International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).
- Roldán, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).
- Solé, A., Diestra, E., Esteve, I. Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats. Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).
- Ramírez, O., García, A., Rojas, R., Couve, A., Härtel, S. Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).
- Universität Gottingen-Georg-August. SAG Culture Collection of Algae. Universität Gottingen-Georg-August. , (2022).
- Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024 (2020).
- Wolf, E., Schüßler, A. Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).
- Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads. Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).
- Field, A. M. . Discovering Statistics Using R. , (2013).
- Linnet, K. Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data. Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).
- Rosner, B., Grove, D. Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data. Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: from probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Borlinghaus, R. The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission. Optical Fluorescence Microscopy. , (2011).
