Autofluorescenza per valutare la fisiologia delle alghe rosse

Summary

Il presente protocollo descrive l’imaging autofluorescenza passo-passo e la valutazione dei cambiamenti ficobiliproteici nelle alghe rosse sulla base dell’analisi spettrale. Questo è un metodo privo di etichette e non distruttivo per valutare l’adattamento cellulare ad habitat estremi, quando è disponibile solo materiale scarso e le cellule crescono lentamente, o per niente, in condizioni di laboratorio.

Abstract

Le alghe rosse (Rhodophyta) contengono ficobiliproteine e colonizzano gli habitat con luce fioca, tuttavia alcune (ad esempio, alcune specie di Chroothece ) possono anche svilupparsi in pieno sole. La maggior parte delle rodofite sono rosse, tuttavia alcune possono apparire bluastre, a seconda della proporzione di biliproteine blu e rosse (ficocianina e ficoeritrina). Diverse ficobiliproteine possono catturare la luce a diverse lunghezze d’onda e trasmetterla alla clorofilla a, il che rende possibile la fotosintesi in condizioni di luce molto diverse. Questi pigmenti rispondono ai cambiamenti dell’habitat nella luce e la loro autofluorescenza può aiutare a studiare i processi biologici. Utilizzando Chroothece mobilis come organismo modello e la modalità di scansione lambda spettrale in un microscopio confocale, è stato studiato l’adattamento dei pigmenti fotosintetici a diverse luci monocromatiche a livello cellulare per indovinare le condizioni di crescita ottimali della specie. I risultati hanno mostrato che, anche quando il ceppo studiato è stato isolato da una grotta, si è adattato sia a intensità luminose fioche che medie. Il metodo presentato è particolarmente utile per studiare gli organismi fotosintetici che non crescono o crescono molto lentamente in condizioni di laboratorio, come di solito accade per coloro che vivono in habitat estremi.

Introduction

Le alghe rosse, come il genere Chroothece, possono crescere in habitat estremi, dove spesso devono far fronte a marcati cambiamenti ambientali¹. Inondazioni e siccità sono frequenti nelle regioni semi-aride dove questo genere può essere trovato, e alcune specie sono state segnalate in torrenti, scogliere, grotte o persino acque termali². Tuttavia, la maggior parte delle volte, le variabili biologiche, come la competizione o il pascolo, relegano le specie a condizioni non ottimali per la loro crescita. Poiché questi organismi sono spesso difficili da coltivare e non crescono o crescono molto lentamente in condizioni di laboratorio, una delle principali limitazioni è la dimensione del campione disponibile. Pertanto, è molto importante seguire metodi non distruttivi o metodi che comportano una manipolazione minima del campione ^3,4.

Le abilità fisiologiche necessarie per sopravvivere in questi ambienti difficili possono essere monitorate seguendo i cambiamenti nei loro sistemi fotosintetici. I meccanismi metabolici, l’efficienza fotosintetica e la sensibilità alla luce o alle condizioni di coltura possono essere rivelati dai profili di emissione di fluorescenza dei pigmenti, a causa di accurati cambiamenti nel loro trasferimento di energia o intrappolamento 5,6,7,8.

L’autofluorescenza dei composti cellulari può essere utilizzata come marker per la citodiagnosi o come indicatore naturale dello stato cellulare o del metabolismo in risposta a segnali esterni e interni attraverso cambiamenti nell’emissione⁹. Può anche essere usato per discriminare tassonomicamente diversi gruppi di organismi fotosintetici¹⁰. A seconda della posizione filogenetica dei microrganismi fototrofi, si possono trovare diverse caratteristiche di fluorescenza in vivo. Pertanto, un’identificazione tassonomica basata sulle caratteristiche in vivo della fluorescenza fototrofica (compresi gli spettri di assorbimento e di emissione della fluorescenza) è stata tentata in diverse occasioni^11,12. A causa della diversità nei pigmenti accessori tra i taxa di fitoplancton, le differenze nelle lunghezze d’onda alle quali viene stimolata la fluorescenza della clorofilla a (Chl a), o le differenze negli spettri di emissione, possono essere utilizzate per dedurre la tassonomia¹³. Gli spettri di eccitazione ed emissione di fluorescenza in vivo di questi campioni si basano non solo sui phyla delle alghe, ma anche sull’adattamento del fotosistema¹⁴. L’efficienza del trasferimento di energia a Chl a, o il rapporto tra Chl a e pigmenti accessori, e il contenuto di pigmenti cellulari sono sensibili alle condizioni di crescita⁵.

Le alghe rosse, in particolare Chroothece, hanno diversi pigmenti fluorescenti accessori: ficobiliproteine e carotenoidi; I primi si concentrano nei ficobilisomi attaccati ai tilacoidi dei cloroplasti. Le ficobiliproteine (ficocianina, ficoeritrina e alloficocianina) possono catturare la luce a diverse lunghezze d’onda e trasmetterla a Chl a, il che rende possibile la fotosintesi in condizioni di luce e coltura molto diverse¹⁵. Ad esempio, le specie di Chroothece possono crescere all’interno di grotte o quasi emergere in torrenti calcarei leggermente salini².

Le luci monocromatiche influenzano la crescita e la composizione pigmentata degli organismi fotosintetici e sono state studiate per prevenire o controllare la crescita di organismi fotosintetici nelle caverne. Mulec et al. hanno dimostrato che l’illuminazione arricchita di rosso promuove la crescita di cianobatteri, alghe e piante¹⁶. Studi precedenti hanno anche riportato che la luce verde influisce sulla composizione del pigmento dei cianobatteri¹⁷, mentre altri hanno rivelato che la luce verde impedisce la crescita della maggior parte degli organismi fotosintetici e alcuni cianobatteri mostrano una riduzione dei tilacoidi e un’intensità media di fluorescenza più debole¹⁸.

Per comprendere la capacità di Chroothece come organismo modello di superare condizioni difficili, le cellule coltivate sono state esposte a crescenti intensità luminose e luce monocromatica (verde o rossa)¹⁵, per vedere come affronta le condizioni di scarsa illuminazione delle grotte (dove predomina la luce rossa). Il protocollo qui presentato riproduce l’effetto delle suddette variabili sulle ficobiliproteine di Chroothece a livello cellulare utilizzando la propria autofluorescenza.

Al giorno d’oggi, la fluorescenza è comunemente usata come strumento per studiare le risposte fisiologiche di piante vascolari, microalghe, macroalghe e cianobatteri^13,14,16. La microscopia a fluorescenza confocale spettrale è uno strumento eccellente per gli studi in vivo per valutare la fisiologia dei campioni fotosintetici a livello di singola cellula 10,17,18,19,20^, evitando i problemi associati al basso tasso di crescita de laboratorio e le difficoltà di ottenere abbastanza biomassa per i metodi di estrazione e biochimici associati⁸ . Una volta che le cellule vengono trattate in diverse condizioni di coltura per 2 settimane, il profilo di scansione lambda può essere misurato in vivo. Sebbene ci siano diverse pubblicazioni in cui sono state utilizzate diverse lunghezze d’onda di eccitazione mediante imaging confocale ^3,4,10,17, la maggior parte delle ficobiliproteine e Chl a possono essere rilevate utilizzando una linea di eccitazione a lunghezza d’onda di 561 nm e l’emissione rilevata varia da 570 a ⁷⁶⁰ nm di lunghezza d’onda. Questi criteri sono stati basati su un’analisi precedentemente eseguita 10 con pigmenti puri commerciali (Tabella 1) mediante imaging confocale e sui risultati ottenuti in diverse specie di alghe^20,21,22.

Pigmenti	λflmax (nm)	λ exc (nm)
		351	364	458	476	488	514	543	633
Chl a	660.9-678.1	43,4 ± 1,8	11,2 ± 0,2	1,8 ± 0,05	2,0 ± 0,08	12,2 ± 0,7	6,0 ± 0,3	4,2 ± 0,16	80,7 ± 1,5
R-PE	569.2-583.3	5,9 ± 0,6	5,9 ± 0,16	11,1 ± 0,04	42,2 ± 0,3	100,0 ± 0	90,0 ± 0,3	99,2 ± 0,08	–
	652.1-668.6	–	–	1,5 ± 0,01	3,7 ± 0,04	26,7 ± 0,5	8,7 ± 0,16	11,1 ± 0,16	11,3 ± 0,2
C-PC	636.2-676.4	2,3 ± 0,04	1,0 ± 0,01	0,6 ± 0,004	0,7 ± 0,008	2,0 ± 0,08	2,0 ± 0,04	3,3 ± 0,16	33,6 ± 0,9
APC-XL	667.3-683.8	15,1 ± 1,5	9,6 ± 0,98	1,0 ± 0,04	1,2 ± 0,08	5,9 ± 0,7	4,1 ± 0,5	23,2 ± 3,5	91,4 ± 2,3

Tabella 1: Informazioni sui pigmenti puri utilizzate per eseguire l’analisi della scansione lambda. Questa tabella mostra i picchi di emissione e i massimi di banda di spalle/fluorescenza di diversi fluorocromi/pigmenti mediante spettrofotometria di imaging confocale per tutte le lunghezze d’onda di eccitazione e la percentuale di emissione luminosa da parte di pigmenti/fluorocromi. I valori sono stati calcolati con la formula: = MFI*100/255. Ogni valore è la media ± SE (media ± errore standard dalla media). Per calibrare il microscopio laser a scansione confocale sono stati utilizzati pigmenti puri come segue ^1,2,10. La clorofilla a è stata ottenuta da Spinacia oleracea, R-phycoerythrin (R-PE) da Porphyra tenera e C-phycocyanin (C-PE) da Spirulina sp. Tutte le specie sono state sciolte in acqua distillata filtrata. L’allophycocyanin-XL (APC-XL) è stata ottenuta da Mastigocladus laminosus, che è stato sciolto in solfato di ammonio (60%) e fosfato di potassio (pH = 7) per raggiungere una concentrazione di 38 mM. Le scansioni sono state eseguite con 400 μL di ciascuna soluzione di pigmento (concentrazione di 1 mg/ml) utilizzando una camera inferiore di vetro coperta a 8 pozzetti.

Lo studio di una singola lunghezza d’onda di eccitazione è una prima approssimazione abbastanza utile. In questo caso, tuttavia, è necessario chiarire il contributo relativo dei diversi complessi nel segnale di fluorescenza, che si raccomanda di eseguire un rapporto di fluorescenza o un’analisi dello spettro a diverse lunghezze d’onda, tra gli altri metodi.

Protocol

La specie algale Chroothece mobilis è stata utilizzata per il presente studio. La specie è stata ottenuta dalla collezione di colture Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. Una panoramica del protocollo è illustrata nella Figura 1. Figura 1: Panoramica dello studio. Chrooth…

Representative Results

La clorofilla a generalmente assorbe le lunghezze d’onda blu e rosse della luce visibile, mentre le ficobiliproteine usano lunghezze d’onda verdi, gialle e arancioni7. L’autofluorescenza di questi pigmenti rende possibile il primo approccio per studiare le ficobiliproteine e il comportamento della clorofilla in condizioni sperimentali e di campo. Confrontando i dati ottenuti e tracciando su grafici diversi, è possibile distinguere cambiamenti significativi nell’intensi…

Discussion

Alcune alghe rosse unicellulari o coloniali, come Chroothece, crescono lentamente in vitro, ma contengono più composti autofluorescenti che possono essere analizzati mediante analisi spettrale al microscopio confocale, dove possono essere rilevate differenze nei picchi di emissione di pigmento. La microscopia a fluorescenza confocale spettrale ha permesso di condurre studi in vivo per valutare l’adattamento o l’acclimatazione di organismi fotosintetici 8,10,17,18,19,20.…

Materials

µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom	Ibidi	81158	–
24 black well plate	Ibidi	82406	flat and clear bottom for high throughput microscopy
Algae Incubator	Panasonic	MLR-352-PE
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	SP8 TCS	–
Flask	Fisher Scientific	15380591	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
green filter	PNTA, LEE filters	–	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2	Leica Microsystems	506353	Glycerol immersion lens
Image acquisition software. LAS X	Leica Microsystems	SP8 TCS	–
Light source	Panasonic	FL40SSENW/37MLR-352-PE
Quantum photoradiometer	DeltaOhm	DO 9721	–
R software	R Core Team, 2020	4.0.2.	–
red filter	PNTA, LEE filters	–	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
SWES medium	University of Murcia	–	–
Type G Immersion liquid	Leica Microsystems	11513910	Glycerol