홍조류 생리학을 평가하기 위한 자가형광 이미징
Summary
본 프로토콜은 스펙트럼 분석을 기반으로 홍조류의 phycobiliprotein 변화의 단계별 자가형광 이미징 및 평가를 설명합니다. 이것은 실험실 조건에서 희소한 물질만 사용할 수 있고 세포가 천천히 성장하거나 전혀 성장하지 않는 극한 서식지에 대한 세포 적응을 평가하기 위한 라벨이 없는 비파괴 방법입니다.
Abstract
홍조류 (Rhodophyta)는 phycobiliproteins를 함유하고 희미한 빛으로 서식지를 식민지화하지만 일부 (예 : 일부 Chroothece 종)는 햇빛이 가득한 곳에서도 자랄 수 있습니다. 대부분의 rhodophytes는 빨간색이지만 일부는 파란색과 빨간색 담즙 단백질 (phycocyanin 및 phycoerythrin)의 비율에 따라 푸르스름하게 보일 수 있습니다. 다른 phycobiliproteins는 다양한 파장에서 빛을 포착하여 엽록소 a로 전달할 수 있으며, 이는 매우 다른 빛 조건에서 광합성을 가능하게합니다. 이 색소는 빛의 서식지 변화에 반응하며 자가 형광은 생물학적 과정을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. Chroothece mobilis 를 모델 유기체로 사용하고 컨포칼 현미경의 스펙트럼 람다 스캔 모드를 사용하여 종의 최적 성장 조건을 추측하기 위해 세포 수준에서 다양한 단색광에 대한 광합성 색소의 적응을 연구했습니다. 결과는 연구 된 균주가 동굴에서 분리 된 경우에도 희미하고 중간 정도의 광도에 적응한다는 것을 보여주었습니다. 제시된 방법은 일반적으로 극한 서식지에 사는 사람들의 경우인 실험실 조건에서 매우 느리게 성장하거나 성장하지 않는 광합성 유기체를 연구하는 데 특히 유용합니다.
Introduction
Chroothece 속과 같은 홍조류는 극한의 서식지에서 자랄 수 있으며, 극한의 서식지에서 자주 나타나 뚜렷한 환경 변화에 대처해야 한다1. 홍수와 가뭄은 이 속이 발견되는 반건조 지역에서 빈번하며, 일부 종은 개울, 절벽, 동굴 또는 심지어 온천수에서도 보고되었다2. 그러나 대부분의 경우 경쟁이나 방목과 같은 생물학적 변수는 종을 성장을위한 최적이 아닌 조건으로 강등시킵니다. 이러한 유기체는 종종 배양하기 어렵고 실험실 조건에서 성장하지 않거나 매우 느리게 성장하기 때문에 한 가지 주요 제한 사항은 사용 가능한 샘플 크기입니다. 따라서 비파괴 방법 또는 최소한의 샘플 조작을 포함하는 방법을 따르는 것이 매우 중요합니다 3,4.
이러한 혹독한 환경에서 생존하는 데 필요한 생리적 기술은 광합성 시스템의 변화를 추적하여 모니터링 할 수 있습니다. 대사 기전, 광합성 효율 및 빛 또는 배양 조건에 대한 민감도는 에너지 전달 또는 포획의 정확한 변화로 인해 색소 형광 방출 프로파일에 의해 밝혀질 수 있습니다 5,6,7,8.
세포 화합물의 자가형광은 세포 진단을 위한 마커로 사용되거나, 방출의 변화를 통한 외부 및 내부 신호에 반응하여 세포 상태 또는 대사의 자연 지표로 사용될 수 있다9. 또한 분류학적으로 다른 광합성 생물 그룹을 구별하는 데 사용할 수 있다10. 광영양 미생물의 계통발생학적 위치에 따라 다양한 생체 내 형광 특징을 찾을 수 있습니다. 그러므로, 광영양 형광(형광 흡수 및 방출 스펙트럼 포함)의 생체 내 특성에 기초한 분류학적 동정이 여러 차례 시도되었다11,12. 식물성 플랑크톤 분류군 간의 부속 색소의 다양성 때문에, 엽록소 a(Chla) 형광이 자극되는 파장의 차이 또는 방출 스펙트럼의 차이를 사용하여 분류법을 추론할 수 있다13. 이 표본의 생체 내 형광 여기 및 방출 스펙트럼은 조류의 문뿐만 아니라 광계 적응에도 의존한다14. Chla에 대한 에너지 전달 효율, 또는 부속 색소에 대한 Chla의 비율, 세포 색소 함량은 성장 조건에 민감하다5.
홍조류, 특히 Chroothece는 몇 가지 보조 형광 색소 인 phycobiliproteins와 카로티노이드를 가지고 있습니다. 전자는 엽록체의 틸라코이드에 부착 된 phycobilisomes에 집중합니다. 피코빌리단백질(피코시아닌, 피코에리트린, 알로피코시아닌)은 서로 다른 파장의 빛을 포착하여 Chl a로 투과시킬 수 있으며, 이는 매우 다른 빛과 배양 조건에서 광합성을 가능하게 한다15. 예를 들어, Chroothece 종은 동굴 내부에서 자라거나 약간 염분이 많은 석회질 개울에서 거의 출현할 수 있다2.
단색광은 광합성 유기체의 성장과 색소 구성에 영향을 미칩니다., 동굴에서 광합성 유기체의 성장을 방지하거나 제어하기 위해 연구되었습니다. Mulec et al. 적색 농축 조명이 시아노박테리아, 조류 및 식물의 성장을 촉진한다는 것을 보여주었다16. 이전 연구에서는 녹색광이 시아노박테리아의 색소 조성에 영향을 미친다고 보고한 바 있으며17, 다른 연구에서는 녹색광이 대부분의 광합성 유기체의 성장을 방해하고 일부 시아노박테리아는 틸라코이드의 감소와 약한 평균 형광 강도를 나타낸다고 보고했다18.
모델 유기체로서 Chroothece 가 가혹한 조건을 극복하는 능력을 이해하기 위해 배양된 세포는 증가하는 빛의 강도와 단색광(녹색 또는 적색)15에 노출되어 동굴의 희미한 조건(적색광이 우세함)에 어떻게 대처하는지 확인했습니다. 본원에 제시된 프로토콜은 자체 자가형광을 사용하여 세포 수준에서 Chroothece의 phycobiliproteins에 대한 상기 언급된 변수의 효과를 재현합니다.
오늘날 형광은 혈관 식물, 미세 조류, 거대 조류 및 시아 노 박테리아의 생리적 반응을 연구하는 도구로 일반적으로 사용됩니다13,14,16. 스펙트럼 컨포칼 형광 현미경은 실험실의 낮은 성장률과 관련된 문제와 관련 추출 및 생화학적 방법을 위한 충분한 바이오매스 확보의 어려움을 방지함으로써 단일 세포 수준 10,17,18,19,20에서 광합성 표본의 생리를 평가하기 위한 생체 내 연구를 위한 탁월한 도구입니다8 . 세포가 2주 동안 상이한 배양 조건 하에서 처리되면, 람다 스캔 프로파일은 생체 내에서 측정될 수 있다. 공초점 이미징에 의한 다양한 여기파장이 사용된 여러 논문이 있지만3,4,10,17, 대부분의 피코빌리단백질과 Chla는 561nm 파장 여기선을 사용하여 검출할 수 있으며, 검출된 방출 범위는 570 내지 760nm 파장이다. 이러한 기준은 공초점 이미징에 의해 상업적인 순수 안료(표 1)로 이전에 수행된 분석 10과 상이한 조류 종(20,21,22)에서 얻어진 결과를 기반으로 한다.
| 안료 | λflmax (nm) | λ exc (nm) | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| Chl a | 660.9-678.1 | 43.4 ± 1.8 | 11.2 ± 0.2 | 1.8 ± 0.05 | 2.0 ± 0.08 | 12.2 ± 0.7 | 6.0 ± 0.3 | 4.2 ± 0.16 | 80.7 ± 1.5 |
| R-PE (알-PE) | 569.2-583.3 | 5.9 ± 0.6 | 5.9 ± 0.16 | 11.1 ± 0.04 | 42.2 ± 0.3 | 100.0 ± 0 | 90.0 ± 0.3 | 99.2 ± 0.08 | – |
| 652.1-668.6 | – | – | 1.5 ± 0.01 | 3.7 ± 0.04 | 26.7 ± 0.5 | 8.7 ± 0.16 | 11.1 ± 0.16 | 11.3 ± 0.2 | |
| 씨-PC | 636.2-676.4 | 2.3 ± 0.04 | 1.0 ± 0.01 | 0.6 ± 0.004 | 0.7 ± 0.008 | 2.0 ± 0.08 | 2.0 ± 0.04 | 3.3 ± 0.16 | 33.6 ± 0.9 |
| APC-XL〈블랙〉 | 667.3-683.8 | 15.1 ± 1.5 | 9.6 ± 0.98 | 1.0 ± 0.04 | 1.2 ± 0.08 | 5.9 ± 0.7 | 4.1 ± 0.5 | 23.2 ± 3.5 | 91.4 ± 2.3 |
표 1: 람다 스캔 분석을 실행하는 데 사용되는 순수 안료 정보. 이 표는 모든 여기 파장에 대한 컨포칼 이미징 분광 광도법에 의한 다양한 형광색소/안료의 발광 피크 및 숄더/형광 대역 최대값과 안료/형광 색소에 의한 발광 비율을 보여줍니다. 값은 공식에 의해 계산되었습니다: = MFI*100/255. 각 값은 평균 ± SE(평균에서 평균 ± 표준 오차)입니다. 순수 안료는 공초점 주사 레이저 현미경의 보정을 위해 하기 1,2,10과 같이 사용하였다. 엽록소 a는 Spinacia oleracea에서, R-피코에리트린(R-PE)은 포르피라 테네라에서, C-피코시아닌(C-PE)은 스피룰리나 sp.에서 얻었습니다. 모든 종을 여과된 증류수에 용해시켰다. 알로피코시아닌-XL(APC-XL)은 황산암모늄(60%)과 인산칼륨(pH = 7)에 용해시켜 38mM의 농도를 달성한 Mastigocladus laminosus로부터 얻었습니다. 스캔은 8웰 덮개 유리 바닥 챔버를 사용하여 각 안료 용액(농도 1mg/mL)의 400μL로 수행되었습니다.
단일 여기 파장에 대한 연구는 매우 유용한 첫 번째 근사치입니다. 그러나 이 경우 형광 신호에서 서로 다른 복합체의 상대적 기여도를 설명할 필요가 있으며, 이는 다른 방법 중에서 여러 파장에서 형광 비율 또는 스펙트럼 분석을 수행하는 것이 좋습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chroothece와 같은 일부 단세포 또는 식민지 홍조류는 시험관 내에서 천천히 성장하지만 안료 방출 피크의 차이를 감지할 수 있는 컨포칼 현미경 하에서 스펙트럼 분석으로 분석할 수 있는 여러 자가형광 화합물을 포함합니다. 스펙트럼 공초점 형광 현미경을 통해 광합성 유기체 8,10,17,18,19,20의 적응 또는 순응을 평가하기 위한<sup clas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 프로젝트 TIN2015-68454-R 및 20961/PI/18의 일환으로 수행되었으며, 스페인 경제 경쟁력부와 무르시아 지역의 세네카 재단이 자금을 지원했습니다. 무르시아 대학교 과학 및 연구 분야의 통계 지원 부서의 Irene Hernández Martínez와 Francisco Javier Ibáñez López (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia (그림 1 )는 Servier Medical Art의 그림을 사용하여 그려졌습니다. Servier의 Servier Medical Art는 Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)로 라이선스가 부여되었습니다.
Materials
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | – |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | – |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | – |
| red filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | – | – |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
Referências
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