Imagem de autofluorescência para avaliar a fisiologia das algas vermelhas

Summary

O presente protocolo descreve imagens de autofluorescência passo a passo e avaliação de alterações ficobiliproteicas em algas vermelhas com base na análise espectral. Este é um método livre de rótulos e não destrutivo para avaliar a adaptação celular a habitats extremos, quando apenas material escasso está disponível e as células crescem lentamente, ou não, em condições de laboratório.

Abstract

As algas vermelhas (Rhodophyta) contêm ficobiliproteínas e colonizam habitats com pouca luz, no entanto, algumas (por exemplo, algumas espécies de Chroothece ) também podem se desenvolver em plena luz solar. A maioria dos rodófitos são vermelhos, no entanto, alguns podem parecer azulados, dependendo da proporção de biliproteínas azuis e vermelhas (ficocianina e ficoeritrina). Diferentes ficobiliproteínas podem capturar a luz em diversos comprimentos de onda e transmiti-la para a clorofila a, o que torna possível a fotossíntese sob condições de luz muito diferentes. Esses pigmentos respondem a mudanças de habitat na luz, e sua autofluorescência pode ajudar a estudar processos biológicos. Usando o Chroothece mobilis como um organismo modelo e o modo de varredura lambda espectral em um microscópio confocal, a adaptação de pigmentos fotossintéticos a diferentes luzes monocromáticas foi estudada no nível celular para adivinhar as condições ideais de crescimento da espécie. Os resultados mostraram que, mesmo quando a cepa estudada foi isolada de uma caverna, ela se adaptou a intensidades de luz fraca e média. O método apresentado é especialmente útil para estudar organismos fotossintéticos que não crescem ou crescem muito lentamente em condições de laboratório, o que geralmente é o caso daqueles que vivem em habitats extremos.

Introduction

As algas vermelhas, como o gênero Chroothece, podem crescer em habitats extremos, onde frequentemente têm que lidar com mudanças ambientais marcantes¹. Inundações e secas são frequentes em regiões semiáridas onde esse gênero pode ser encontrado, e algumas espécies têm sido relatadas em riachos, falésias, cavernas ou mesmo águas termais². No entanto, na maioria das vezes, variáveis biológicas, como competição ou pastoreio, relegam as espécies a condições não ótimas para o seu crescimento. Como esses organismos são muitas vezes difíceis de cultivar e não crescem ou crescem muito lentamente em condições de laboratório, uma grande limitação é o tamanho da amostra disponível. Portanto, é muito importante seguir métodos não destrutivos ou que envolvam manipulação mínima da amostra ^3,4.

As habilidades fisiológicas necessárias para sobreviver nesses ambientes hostis podem ser monitoradas seguindo as mudanças em seus sistemas fotossintéticos. Mecanismos metabólicos, eficiência fotossintética e sensibilidade à luz ou condições de cultura podem ser revelados por perfis de emissão de fluorescência de pigmentos, devido a mudanças precisas em sua transferência de energia ou aprisionamento 5,6,7,8.

A autofluorescência de compostos celulares pode ser utilizada como marcador para citodiagnóstico ou como indicador natural do estado celular ou metabolismo em resposta a sinais externos e internos por meio de alterações na emissão⁹. Também pode ser usado para discriminar taxonomicamente diferentes grupos de organismos fotossintéticos¹⁰. Dependendo da posição filogenética de microrganismos fototróficos, pode-se encontrar diferentes características de fluorescência in vivo. Portanto, uma identificação taxonômica baseada nas características in vivo da fluorescência fototrófica (incluindo espectros de absorção e emissão de fluorescência) tem sido tentada em várias ocasiões^11,12. Devido à diversidade de pigmentos acessórios entre os táxons fitoplâncton, diferenças nos comprimentos de onda nos quais a fluorescência da clorofila a (Chl a) é estimulada, ou diferenças nos espectros de emissão, podem ser usadas para inferir taxonomia¹³. Os espectros de excitação e emissão de fluorescência in vivo desses espécimes dependem não apenas do filo de algas, mas também da adaptação do fotossistema¹⁴. A eficiência da transferência de energia para Chl a, ou a razão de Chl a para pigmentos acessórios, e o conteúdo de pigmentos celulares são sensíveis às condições de crescimento⁵.

As algas vermelhas, particularmente Chroothece, têm vários pigmentos fluorescentes acessórios – ficobiliproteínas e carotenoides; os primeiros concentram-se em ficobilissomas ligados aos tilacóides dos cloroplastos. As ficobiliproteínas (ficocianina, ficoeritrina e aloficocianina) podem capturar a luz em diferentes comprimentos de onda e transmiti-la para Chl a, o que possibilita a fotossíntese em condições de luz e cultura muito diferentes¹⁵. Por exemplo, as espécies de Chroothece podem crescer dentro de cavernas ou quase emergir em riachos calcários ligeiramente salinos².

As luzes monocromáticas afetam o crescimento e a composição pigmentar de organismos fotossintéticos e têm sido estudadas para prevenir ou controlar o crescimento de organismos fotossintéticos em cavernas. Mulec et al. mostraram que a iluminação enriquecida com vermelho promove o crescimento de cianobactérias, algas e plantas¹⁶. Estudos anteriores também relataram que a luz verde afeta a composição pigmentar das cianobactérias¹⁷, enquanto outros revelaram que a luz verde impede o crescimento da maioria dos organismos fotossintéticos e algumas cianobactérias exibem uma redução nos tilacóides e uma intensidade média de fluorescência mais fraca¹⁸.

Para entender a capacidade do Chroothece como um organismo modelo de superar condições adversas, células cultivadas foram expostas a intensidades de luz crescentes e luz monocromática (verde ou vermelha)¹⁵, para ver como ele lida com as condições sombrias das cavernas (onde a luz vermelha predomina). O protocolo aqui apresentado reproduz o efeito das variáveis acima mencionadas sobre as ficobiliproteínas de Chroothece no nível celular usando sua própria autofluorescência.

Atualmente, a fluorescência é comumente utilizada como ferramenta para estudar as respostas fisiológicas de plantas vasculares, microalgas, macroalgas e cianobactérias^13,14,16. A microscopia de fluorescência confocal espectral é uma excelente ferramenta para estudos in vivo avaliarem a fisiologia de espécimes fotossintéticos no nível unicelular 10,17,18,19,20^, evitando problemas associados à baixa taxa de crescimento em laboratório e às dificuldades de obtenção de biomassa suficiente para os métodos de extração e bioquímicos associados⁸ . Uma vez que as células são tratadas sob diferentes condições de cultura por 2 semanas, o perfil de varredura lambda pode ser medido in vivo. Embora existam várias publicações em que diferentes comprimentos de onda de excitação por imagem confocal tenham sido utilizados 3,4,10,17, a maioria das ficobiliproteínas e Chl a pode ser detectada usando uma linha de excitação de comprimento de onda de 561 nm^, e a emissão detectada varia de 570 a ⁷⁶⁰ nm de comprimento de onda. Esses critérios foram baseados em uma análise previamente realizada 10 com pigmentos puros comerciais (Tabela 1) por imagem confocal e nos resultados obtidos em diferentes espécies de algas^20,21,22.

Pigmentos	λflmax (nm)	λ exc (nm)
		351	364	458	476	488	514	543	633
Chl a	660.9-678.1	43,4 ± 1,8	11,2 ± 0,2	1,8 ± 0,05	2,0 ± 0,08	12,2 ± 0,7	6,0 ± 0,3	4.2 ± 0.16	80,7 ± 1,5
R-PE	569.2-583.3	5,9 ± 0,6	5,9 ± 0,16	11,1 ± 0,04	42,2 ± 0,3	100,0 ± 0	90,0 ± 0,3	99,2 ± 0,08	–
	652.1-668.6	–	–	1,5 ± 0,01	3,7 ± 0,04	26,7 ± 0,5	8,7 ± 0,16	11,1 ± 0,16	11,3 ± 0,2
C-PC	636.2-676.4	2,3 ± 0,04	1,0 ± 0,01	0,6 ± 0,004	0,7 ± 0,008	2,0 ± 0,08	2,0 ± 0,04	3,3 ± 0,16	33,6 ± 0,9
APC-XL	667.3-683.8	15,1 ± 1,5	9,6 ± 0,98	1,0 ± 0,04	1,2 ± 0,08	5,9 ± 0,7	4,1 ± 0,5	23,2 ± 3,5	91,4 ± 2,3

Tabela 1: As informações de pigmento puro usadas para executar a análise de varredura lambda. Esta tabela mostra os picos de emissão e os máximos de ombros/banda de fluorescência de diferentes fluorocromos/pigmentos por espectrofotometria de imagem confocal para todos os comprimentos de onda de excitação e a porcentagem de emissão de luz por pigmentos/fluorocromos. Os valores foram calculados pela fórmula: = IFM*100/255. Cada valor é a média ± SE (média ± erro padrão da média). Pigmentos puros foram utilizados para calibrar o microscópio a laser de varredura confocal da seguinte^{forma 1,2,10}. A clorofila a foi obtida de Spinacia oleracea, R-ficoeritrina (R-PE) de Porphyra tenera e C-ficocianina (C-PE) de Spirulina sp. Todas as espécies foram dissolvidas em água destilada filtrada. A aloficocianina-XL (APC-XL) foi obtida de Mastigocladus laminosus, que foi dissolvido em sulfato de amônio (60%) e fosfato de potássio (pH = 7) para atingir uma concentração de 38 mM. Os exames foram realizados com 400 μL de cada solução pigmentar (concentração de 1 mg/mL) utilizando uma câmara de fundo de vidro coberto de 8 poços.

O estudo de um único comprimento de onda de excitação é uma primeira aproximação bastante útil. Neste caso, no entanto, é necessário elucidar a contribuição relativa dos diferentes complexos no sinal de fluorescência, o que é recomendado para realizar uma razão de fluorescência ou análise de espectro em vários comprimentos de onda, entre outros métodos.

Protocol

A espécie de algas Chroothece mobilis foi utilizada para o presente estudo. A espécie foi obtida a partir da coleção de cultura Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. Uma visão geral do protocolo é mostrada na Figura 1. Figura 1: Visão geral do estudo. Chroothece mobili…

Representative Results

A clorofila a geralmente absorve os comprimentos de onda azul e vermelho da luz visível, enquanto as ficobiliproteínas usam comprimentos de onda verde, amarelo e laranja7. A autofluorescência desses pigmentos possibilita a primeira abordagem para estudar ficobiliproteínas e o comportamento da clorofila em condições experimentais e de campo. Comparando-se os dados obtidos e plotando-se em diferentes gráficos, pode-se distinguir mudanças significativas na intensid…

Discussion

Algumas algas vermelhas unicelulares ou coloniais, como Chroothece, crescem lentamente in vitro, mas contêm vários compostos autofluorescentes que podem ser analisados por análise espectral sob um microscópio confocal, onde diferenças nos picos de emissão de pigmentos podem ser detectadas. A microscopia de fluorescência confocal espectral tem permitido a realização de estudos in vivo para avaliar a adaptação ou aclimatação de organismos fotossintéticos 8,10,17,18,19,20.<sup class=…

Materials

µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom	Ibidi	81158	–
24 black well plate	Ibidi	82406	flat and clear bottom for high throughput microscopy
Algae Incubator	Panasonic	MLR-352-PE
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	SP8 TCS	–
Flask	Fisher Scientific	15380591	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
green filter	PNTA, LEE filters	–	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2	Leica Microsystems	506353	Glycerol immersion lens
Image acquisition software. LAS X	Leica Microsystems	SP8 TCS	–
Light source	Panasonic	FL40SSENW/37MLR-352-PE
Quantum photoradiometer	DeltaOhm	DO 9721	–
R software	R Core Team, 2020	4.0.2.	–
red filter	PNTA, LEE filters	–	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
SWES medium	University of Murcia	–	–
Type G Immersion liquid	Leica Microsystems	11513910	Glycerol