תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הקמת מערכת אורגנואידית של המעי הגס כדי לחקור את הפעילות והתפקוד של תאי גזע המעי הגס במודל נוקאאוט של קלודין-7.
Abstract
אפיתל המעי מתחדש כל 5-7 ימים, ונשלט על ידי אוכלוסיית תאי הגזע של אפיתל המעי (IESC) הממוקמת בתחתית אזור הקריפטה. IESCs כוללים תאי גזע פעילים, המחדשים את עצמם ומתמיינים לסוגי תאי אפיתל שונים, ותאי גזע שקטים, המשמשים כתאי גזע עתודות במקרה של פציעה. התחדשות אפיתל המעי נשלטת על ידי יכולות ההתחדשות וההבחנה של IESCs פעילים אלה. בנוסף, איזון אוכלוסיית תאי הגזע בקריפטה ושמירה על נישת תאי הגזע חיוניים להתחדשות המעיים. תרבית אורגנואידית היא גישה חשובה ואטרקטיבית לחקר חלבונים, מולקולות איתות ורמזים סביבתיים המווסתים את ההישרדות והתפקוד של תאי גזע. דגם זה זול יותר, גוזל פחות זמן וניתן למניפולציה רבה יותר ממודלים של בעלי חיים. אורגנואידים גם מחקים את המיקרו-סביבה של הרקמה, ומספקים רלוונטיות in vivo . הפרוטוקול הנוכחי מתאר את בידודן של קריפטות המעי הגס, הטמעת תאי קריפטה מבודדים אלה במערכת מטריצת ג’ל תלת-ממדית והפיכת תאי קריפטה ליצירת אורגנואידים של המעי הגס המסוגלים לארגון עצמי, התפשטות, התחדשות עצמית והתמיינות. מודל זה מאפשר לאדם לתמרן את הסביבה – לדפוק חלבונים ספציפיים כגון claudin-7, הפעלה/השבתה של מסלולי איתות וכו’ – כדי לחקור כיצד השפעות אלה משפיעות על תפקודם של תאי גזע במעי הגס. באופן ספציפי, נבדק תפקידו של חלבון הצומת ההדוק קלודין-7 בתפקוד תאי גזע המעי הגס. Claudin-7 חיוני לשמירה על הומאוסטזיס במעיים ועל תפקוד המחסום ותקינותם. נוקאאוט של קלודין-7 בעכברים גורם לפנוטיפ דמוי מחלת מעי דלקתית המציג דלקת מעיים, היפרפלזיה אפיתליאלית, ירידה במשקל, כיבים ברירית, רפיון תאי אפיתל ואדנומות. בעבר דווח כי קלודין-7 נדרש לתפקודי תאי גזע אפיתל במעי הדק. בפרוטוקול זה, מערכת תרבית אורגנואידית המעי הגס הוקמה כדי לחקור את התפקיד של claudin-7 במעי הגס.
Introduction
תרבית אורגנואידית מעיים היא מערכת ex vivo תלת-ממדית (3D) שבה מבודדים תאי גזע משכבות המעיים של הרקמה הראשונית ומצופים למטריצת ג’ל 1,2. תאי גזע אלה מסוגלים להתחדשות עצמית, ארגון עצמי ותפקוד איברים2. אורגנואידים מחקים את המיקרו-סביבה של הרקמה ודומים יותר למודלים של in vivo מאשר למודלים דו-ממדיים (דו-ממדיים) של תרביות תאים במבחנה, אם כי פחות ניתנים למניפולציה מאשר לתאים 3,4. מודל זה מבטל מכשולים שנתקלים בהם במודלים דו-ממדיים, כגון היעדר הידבקויות תקינות בין תאים לתאים, אינטראקציות בין תאים ואוכלוסיות הומוגניות, וגם מצמצם את המגבלות של מודלים של בעלי חיים, כולל עלויות גבוהות ותקופות זמן ארוכות5. אורגנואידים במעיים – המכונים גם קולונואידים עבור אלה שגדלו מתאי גזע שמקורם בקריפטה של המעי הגס – הם למעשה מיני-איברים המכילים אפיתל הכולל את כל סוגי התאים שיהיו נוכחים ב- vivo, כמו גם לומן. מודל זה מאפשר מניפולציה של המערכת כדי לחקור היבטים רבים של המעי, כגון נישה של תאי גזע, פיזיולוגיה של המעי, פתופיזיולוגיה ומורפוגנזה של המעיים 3,5,6. הוא גם מספק מודל נהדר לגילוי תרופות, חקר הפרעות מעיים אנושיות כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD) וסרטן המעי הגס, פיתוח טיפול מותאם אישית ספציפי למטופל, וחקר התחדשות רקמות 4,7,8,9. בנוסף, המערכת האורגנואידית יכולה לשמש גם לחקר תקשורת תאית, מטבוליזם של תרופות, כדאיות, התפשטות ותגובה לגירויים 7,8. בעוד שניתן להשתמש במודלים של בעלי חיים כדי לבחון טיפולים פוטנציאליים עבור מצבים פתולוגיים במעיים, הם מוגבלים למדי, מכיוון שחקר תרופות מרובות בו-זמנית מהווה אתגר. ישנם משתנים מבלבלים יותר in vivo, והעלות והזמן הקשורים הם גבוהים וארוכים, בהתאמה. מאידך גיסא, מערכת התרבית האורגנואידית מאפשרת סינון של טיפולים רבים בבת אחת בפרק זמן קצר יותר וכן מאפשרת טיפול מותאם אישית באמצעות שימוש בתרבית אורגנואידיתשמקורה בחולה 4,8. היכולת של אורגנואידים במעי הגס לחקות ארגון רקמות, מיקרו-סביבה ופונקציונליות הופכת אותם גם למודל מצוין לחקר התחדשות ותיקון רקמות9. המעבדה שלנו הקימה מערכת תרבית אורגנואידית במעי הדק כדי לחקור את ההשפעה של קלודין-7 על תפקודי תאי גזע במעי הדק10. במחקר זה הוקמה מערכת תרבית אורגנואידית במעי הגס כדי לחקור את יכולתם, או חוסר יכולתם של תאי גזע, לחדש את עצמם, להתמיין ולהתרבות במודל של נוקאאוט קלודין-7 מותנה (cKO).
קלודין-7 הוא חלבון חשוב מאוד של צומת הדוק (TJ) המתבטא מאוד במעי וחיוני לשמירה על תפקוד ותקינות TJ11. עכברי cKO סובלים מפנוטיפ דמוי IBD, המציג דלקת קשה, כיבים, רפיון תאי אפיתל, אדנומות ורמות ציטוקינים מוגברות11,12. בעוד שמקובל לחשוב שקלודינים חיוניים לתפקוד מחסום אפיתל, מתפתחים תפקידים חדשים לקלאודינים; הם מעורבים בהתפשטות, הגירה, התקדמות סרטן ותפקוד תאי גזע 10,12,13,14,15,16,17. כיום לא ידוע כיצד קלודין-7 משפיע על נישה של תאי גזע ותפקוד של תאי גזע במעי הגס. מכיוון שהמעי מתחדש במהירות כל 5-7 ימים בערך, תחזוקה של נישת תאי הגזע ותפקוד תקין של תאי הגזע הפעילים חיוניים18. כאן הוקמה מערכת לבחינת ההשפעות הרגולטוריות הפוטנציאליות של קלודין-7 על נישת תאי הגזע של המעי הגס.
Protocol
Representative Results
Discussion
תרבית אורגנואידית היא מודל מצוין לחקר תפקוד תאי גזע, פיזיולוגיה של המעי, גילוי תרופות, מחלות מעיים אנושיות והתחדשות ותיקון רקמות 7,8,9,10,11,26. אמנם יש לו יתרונות רבים, אך הוא יכול להיות …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי NIH DK103166.
Materials
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
Referências
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Wallach, T. E., Bayrer, J. R. Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).
- Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).
- Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research. Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).
- Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications. Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).
- Gupta, N., et al. Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research. Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).
- Yoo, J., Donowitz, M. Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).
- Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
- Xing, T., et al. Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).
- Ding, L., et al. Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice. Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).
- Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases. Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).
- Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective. Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).
- Bhat, A. A., et al. Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis. Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).
- Lu, Z., et al. A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement. Molecular Cancer. 14, 120 (2015).
- Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review. Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).
- Wang, K., et al. Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).
- Wang, F., et al. Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).
- Li, W., et al. Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7. Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).
- Sugimoto, K., et al. Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).
- Mansour, H., et al. Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina. PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).
- Miranda, M., et al. Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism. Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).
- Wang, L., et al. Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).
- Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
