Driedimensionale cultuur van Murine Colonic Crypts om de intestinale stamcelfunctie ex vivo te bestuderen
Summary
Het huidige protocol beschrijft het opzetten van een murine colon organoïde systeem om de activiteit en werking van colonstamcellen te bestuderen in een claudin-7 knock-out model.
Abstract
Het darmepitheel regenereert elke 5-7 dagen en wordt gecontroleerd door de intestinale epitheliale stamcelpopulatie (IESC) op de bodem van het cryptegebied. IESCs omvatten actieve stamcellen, die zichzelf vernieuwen en differentiëren in verschillende epitheelceltypen, en rustige stamcellen, die dienen als reservestamcellen in geval van letsel. Regeneratie van het darmepitheel wordt gecontroleerd door de zelfvernieuwende en onderscheidende mogelijkheden van deze actieve IESCs. Bovendien zijn de balans van de crypte stamcelpopulatie en het behoud van de stamcelniche essentieel voor darmregeneratie. Organoïde cultuur is een belangrijke en aantrekkelijke benadering voor het bestuderen van eiwitten, signaalmoleculen en omgevingssignalen die de overleving en functies van stamcellen reguleren. Dit model is goedkoper, minder tijdrovend en beter beheersbaar dan diermodellen. Organoïden bootsen ook de micro-omgeving van het weefsel na en bieden in vivo relevantie. Het huidige protocol beschrijft de isolatie van coloncrypten, het inbedden van deze geïsoleerde cryptecellen in een driedimensionaal gelmatrixsysteem en het kweken van cryptecellen om colonorganoïden te vormen die in staat zijn tot zelforganisatie, proliferatie, zelfvernieuwing en differentiatie. Dit model stelt iemand in staat om de omgeving te manipuleren – het uitschakelen van specifieke eiwitten zoals claudine-7, activerende / deactiverende signaalroutes, enz. – om te bestuderen hoe deze effecten de werking van colonstamcellen beïnvloeden. Specifiek werd de rol van tight junction eiwit claudin-7 in de darmstamcelfunctie onderzocht. Claudin-7 is van vitaal belang voor het behoud van intestinale homeostase en barrièrefunctie en integriteit. Knock-out van claudine-7 bij muizen induceert een inflammatoir darmziekte-achtig fenotype dat darmontsteking, epitheliale hyperplasie, gewichtsverlies, mucosale ulceraties, epitheelcelschimmel en adenomen vertoont. Eerder werd gemeld dat claudine-7 nodig is voor intestinale epitheelstamcelfuncties in de dunne darm. In dit protocol wordt een colon-organoïde kweeksysteem opgezet om de rol van claudine-7 in de dikke darm te bestuderen.
Introduction
Intestinale organoïde cultuur is een driedimensionaal (3D) ex vivo systeem waarbij stamcellen worden geïsoleerd uit de darmcrypten van primair weefsel en verguld in een gelmatrix 1,2. Deze stamcellen zijn in staat tot zelfvernieuwing, zelforganisatie en orgaanfunctionaliteit2. Organoïden bootsen de micro-omgeving van het weefsel na en lijken meer op in vivo modellen dan tweedimensionale (2D) in vitro celkweekmodellen, hoewel minder manipulateerbaar dan cellen 3,4. Dit model elimineert obstakels die worden aangetroffen in 2D-modellen, zoals een gebrek aan goede cel-celverklevingen, cel-matrixinteracties en homogene populaties, en vermindert ook de beperkingen van diermodellen, waaronder hoge kosten en lange perioden van tijd5. Intestinale organoïden – ook wel colonoïden genoemd voor die gekweekt uit van coloncrypten afgeleide stamcellen – zijn in wezen mini-organen die een epitheel bevatten met alle celtypen die in vivo aanwezig zouden zijn, evenals een lumen. Dit model maakt manipulatie van het systeem mogelijk om vele aspecten van de darm te bestuderen, zoals de stamcelniche, darmfysiologie, pathofysiologie en darmmorfogenese 3,5,6. Het biedt ook een geweldig model voor het ontdekken van geneesmiddelen, het bestuderen van menselijke darmaandoeningen zoals inflammatoire darmaandoeningen (IBD) en colorectale kanker, patiëntspecifieke gepersonaliseerde behandelingsontwikkeling en het bestuderen van weefselregeneratie 4,7,8,9. Daarnaast kan het organoïde systeem ook worden gebruikt om cellulaire communicatie, medicijnmetabolisme, levensvatbaarheid, proliferatie en reactie op stimuli te bestuderen 7,8. Hoewel diermodellen kunnen worden gebruikt om potentiële therapieën voor intestinale pathologische aandoeningen te testen, zijn ze vrij beperkt, omdat het bestuderen van meerdere geneesmiddelen tegelijk een uitdaging vormt. Er zijn meer verstorende variabelen in vivo, en de bijbehorende kosten en tijd zijn respectievelijk hoog en lang. Aan de andere kant maakt het organoïde kweeksysteem de screening van veel therapeutica tegelijk in een kortere periode mogelijk en maakt het ook een gepersonaliseerde behandeling mogelijk door het gebruik van van de patiënt afgeleide organoïde cultuur 4,8. Het vermogen van colonorganoïden om weefselorganisatie, micro-omgeving en functionaliteit na te bootsen, maakt ze ook een uitstekend model voor het bestuderen van regeneratie en weefselherstel9. Ons lab heeft een organoïde kweeksysteem voor de dunne darm opgezet om het effect van claudine-7 op de stamcelfuncties van de dunne darm te bestuderen10. In deze studie wordt een groot intestinaal organoïde kweeksysteem opgezet om het vermogen of gebrek aan vermogen van stamcellen te bestuderen om zichzelf te vernieuwen, te differentiëren en te vermenigvuldigen in een voorwaardelijk claudine-7 knock-out (cKO) -model.
Claudin-7 is een zeer belangrijk tight junction (TJ) eiwit dat sterk tot expressie komt in de darm en essentieel is voor het behoud van de TJ-functie en integriteit11. cKO-muizen lijden aan een IBD-achtig fenotype, vertonen ernstige ontstekingen, ulceraties, epitheelcelschilfers, adenomen en verhoogde cytokinespiegels11,12. Hoewel het algemeen aanvaard is dat claudins van vitaal belang zijn voor de epitheliale barrièrefunctie, ontstaan er nieuwe rollen voor claudins; ze zijn betrokken bij proliferatie, migratie, kankerprogressie en stamcelfunctie 10,12,13,14,15,16,17. Het is momenteel onbekend hoe claudine-7 de stamcelniche en -functie van colonstamcellen beïnvloedt. Omdat de darm zichzelf ongeveer elke 5-7 dagen snel vernieuwt, is het behoud van de stamcelniche en de goede werking van de actieve stamcellen van vitaal belang18. Hier wordt een systeem opgezet om de potentiële regulerende effecten van claudine-7 op de colonstamcelniche te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organoïde cultuur is een uitstekend model voor het bestuderen van stamcelfunctie, darmfysiologie, medicijnontdekking, menselijke darmziekten en weefselregeneratie en -reparatie 7,8,9,10,11,26. Hoewel het veel voordelen heeft, kan het een uitdaging zijn om vast te stellen. Voorzichtigheid is geboden in alle stappen in het pro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gefinancierd door NIH DK103166.
Materials
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
Referências
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Wallach, T. E., Bayrer, J. R. Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).
- Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).
- Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research. Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).
- Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications. Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).
- Gupta, N., et al. Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research. Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).
- Yoo, J., Donowitz, M. Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).
- Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
- Xing, T., et al. Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).
- Ding, L., et al. Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice. Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).
- Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases. Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).
- Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective. Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).
- Bhat, A. A., et al. Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis. Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).
- Lu, Z., et al. A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement. Molecular Cancer. 14, 120 (2015).
- Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review. Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).
- Wang, K., et al. Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).
- Wang, F., et al. Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).
- Li, W., et al. Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7. Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).
- Sugimoto, K., et al. Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).
- Mansour, H., et al. Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina. PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).
- Miranda, M., et al. Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism. Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).
- Wang, L., et al. Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).
- Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
