Tredimensjonal kultur av Murine Colonic krypter for å studere intestinal stamcellefunksjon ex vivo

Summary

Denne protokollen beskriver etablering av et murine colonic organoid system for å studere aktiviteten og funksjonen til kolonstamceller i en claudin-7 knockout-modell.

Abstract

Tarmepitelet regenereres hver 5-7 dag, og styres av populasjonen av tarmepitelstamceller (IESC) som ligger nederst i kryptområdet. IESCs inkluderer aktive stamceller, som selvfornyer og differensierer i ulike epitelcelletyper, og hvilende stamceller, som fungerer som reserve stamceller i tilfelle skade. Regenerering av tarmepitelet styres av de selvfornyende og differensierende egenskapene til disse aktive IESC-ene. I tillegg er balansen mellom kryptstamcellepopulasjonen og vedlikehold av stamcellenisjen avgjørende for intestinal regenerering. Organoidkultur er en viktig og attraktiv tilnærming til å studere proteiner, signalmolekyler og miljømessige signaler som regulerer stamcelleoverlevelse og funksjoner. Denne modellen er billigere, mindre tidkrevende og mer manipulerbar enn dyremodeller. Organoider etterligner også vevets mikromiljø, og gir in vivo relevans. Den nåværende protokollen beskriver isoleringen av kolonkrypter, innebygging av disse isolerte kryptcellene i et tredimensjonalt gelmatrisesystem og dyrking av kryptceller for å danne kolonorganoider som er i stand til selvorganisasjon, spredning, selvfornyelse og differensiering. Denne modellen gjør det mulig å manipulere miljøet – slå ut spesifikke proteiner som claudin-7, aktivere / deaktivere signalveier, etc. – for å studere hvordan disse effektene påvirker funksjonen av kolonstamceller. Spesielt ble rollen som tett kryssprotein claudin-7 i kolon stamcellefunksjon undersøkt. Claudin-7 er viktig for å opprettholde intestinal homeostase og barrierefunksjon og integritet. Knockout av claudin-7 hos mus induserer en inflammatorisk tarmsykdomslignende fenotype som utviser tarmbetennelse, epitelhyperplasi, vekttap, slimhinnesår, epitelcellesloughing og adenomer. Tidligere ble det rapportert at claudin-7 er nødvendig for tarmepitelial stamcellefunksjoner i tynntarmen. I denne protokollen er et kolonorganoidkultursystem etablert for å studere rollen som claudin-7 i tyktarmen.

Introduction

Intestinal organoidkultur er et tredimensjonalt (3D) ex vivo-system der stamceller isoleres fra tarmkryptene i primærvev og belagt i en gelmatrise ^1,2. Disse stamcellene er i stand til selvfornyelse, selvorganisering og organfunksjonalitet². Organoider etterligner vevsmikromiljøet og ligner mer på in vivo-modeller enn todimensjonale (2D) in vitro cellekulturmodeller, selv om de er mindre manipulerbare enn celler ^3,4. Denne modellen eliminerer hindringer som oppstår i 2D-modeller, for eksempel mangel på riktig celle-celle-adhesjoner, celle-matrise-interaksjoner og homogene populasjoner, og reduserer også begrensningene i dyremodeller, inkludert høye kostnader og lange tidsperioder⁵. Intestinale organoider – også referert til som kolonoider for de som vokser fra kolonkryptavledede stamceller – er i hovedsak miniorganer som inneholder et epitel, inkludert alle celletyper som ville være tilstede in vivo, samt et lumen. Denne modellen tillater manipulering av systemet for å studere mange aspekter av tarmen, for eksempel stamcellenisje, tarmfysiologi, patofysiologi og tarmmorfogenese ^3,5,6. Det gir også en flott modell for narkotikaforskning, studerer menneskelige tarmlidelser som inflammatorisk tarmsykdom (IBD) og kolorektal kreft, pasientspesifikk personlig behandlingsutvikling og studerer vevregenerering 4,7,8,9. I tillegg kan organoidsystemet også brukes til å studere cellulær kommunikasjon, stoffmetabolisme, levedyktighet, spredning og respons på stimuli ^7,8. Mens dyremodeller kan brukes til å teste potensielle terapier for intestinale patologiske forhold, er de ganske begrensede, da det er en utfordring å studere flere stoffer samtidig. Det er flere forvirrende variabler in vivo, og tilhørende kostnader og tid er henholdsvis høye og lange. På den annen side tillater organoidkultursystemet screening av mange terapier samtidig i en kortere tidsperiode og tillater også personlig behandling ved bruk av pasientavledet organoidkultur ^4,8. Evnen til kolonorganoider til å etterligne vevsorganisasjon, mikromiljø og funksjonalitet gjør dem også til en utmerket modell for å studere regenerering og vevsreparasjon⁹. Vårt laboratorium har etablert et tynntarmorganoidkultursystem for å studere effekten av claudin-7 på tynntarmens stamcellefunksjoner¹⁰. I denne studien er et stort intestinal organoidkultursystem etablert for å studere stamcellers evne, eller mangel på evne, til selvfornyelse, differensiering og spredning i en betinget claudin-7 knockout (cKO) modell.

Claudin-7 er et svært viktig tett kryss (TJ) protein som er sterkt uttrykt i tarmen og er avgjørende for å opprettholde TJ-funksjon og integritet¹¹. cKO-mus lider av en IBD-lignende fenotype, som viser alvorlig betennelse, sårdannelser, epitelcelle-sloughing, adenomer og økte cytokinnivåer^11,12. Selv om det er allment akseptert at claudiner er avgjørende for epitelbarrierefunksjon, dukker det opp nye roller for claudiner; De er involvert i spredning, migrasjon, kreftprogresjon og stamcellefunksjon 10,12,13,14,15,16,17. Det er foreløpig ukjent hvordan claudin-7 påvirker stamcellenisjen og funksjonen til kolonstamceller. Siden tarmen raskt fornyes omtrent hver 5-7 dag, er vedlikehold av stamcellenisjen og riktig funksjon av de aktive stamcellene avgjørende¹⁸. Her etableres et system for å undersøke de potensielle regulatoriske effektene av claudin-7 på colonic stamcelle nisje.

Protocol

Alle dyreforsøk og prosedyrer ble godkjent av East Carolina University (ECU) Animal Care and Use Committee (IACUC) og utført i samsvar med retningslinjer fra National Institutes of Health og ECU om pleie og bruk av forsøksdyr. Induserbare, tarmspesifikke claudin-7 knockoutmus ble generert ved å krysse C57BL6 claudin-7-flox transgene mus med Villin-CreERT2 mus19. Hann- og hunnmus i alderen 3 måneder ble brukt i denne studien. 1. Klargjøring av reagens/utstyr<…

Representative Results

For å undersøke reguleringseffektene av claudin-7 på kolonstamceller ble kolonkrypter isolert fra murine kolonvev som beskrevet ovenfor og vist i figur 1A. Når kryptene var isolert fra primærvevet, ble de belagt i en 3D-matrise i en 96-brønnsplate for å vokse i 11 dager (figur 1). Normale friske krypter vil lukke lumen og bli sfæroider innen dag 2 og til slutt begynne å spire og danne de forskjellige epitelcelletypene omtrent på dag 5 (<strong class="x…

Discussion

Organoidkultur er en utmerket modell for å studere stamcellefunksjon, tarmfysiologi, narkotikaforskning, menneskelige tarmsykdommer og vevregenerering og reparasjon 7,8,9,10,11,26. Selv om det har mange fordeler, kan det være utfordrende å etablere. Det må utvises forsiktighet i alle trinn gjennom protokollen, men viktigs…

Materials

0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator	United States Plastic Corp	78564	anesthesia chamber
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9261
1.5 mL microcentrifuge tubes	ThermoFisher	69715
15 mL conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-959-53A
1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline	Gibco	14190-144
2-methylbutane	Sigma	277258
4% paraformaldehyde	ThermoFisher	J61899.AK
4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)	Sigma	579002
50 mL conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	14-432-22
70 µm nylon cell strainer	Corning	352350
96 well culture plate	Greiner Bio-One	655180
B-27 Supplement (50x)	Gibco	12587-010
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	BP1605-100
Claudin-7 anti-murine rabbit antibody	Immuno-Biological Laboratories	18875
Cover glass (24 x 50-1.5)	Fisher Scientific	12544E
Cryomolds	vwr	25608-916
Cultrex RCF BME, Type 2	R&D Systems	3533-005-02	gel matrix
Cy3 anti-rabbit antibody	Jackson Immunoresearch	111-165-003
Dewar Flask	Thomas Scientific	1173F61
DMEM High Glucose with L-Glutamine	ATCC	30-2002
EVOS FLoid Imaging System	ThermoFisher	4477136
Fluoro-Gel II with DAPI	Electron Microscopy Sciences	17985-50
GlutaMAX (100x)	Gibco	35050-061
Glycine	JT Baker	4059-02
HEPES (1 M) Buffer Solution	Gibco	15630-080
Hoechst	ThermoFisher	62249
In situ cell death detection kit, TMR Red	Roche	12156792910
Isoflurane	Pivetal	07-893-8440
L-WRN Media	Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core	N/A
Mouse surgical kit	Kent Scientific Corporation	INSMOUSEKIT
Murine EGF	PeproTech	315-09-500UG
N2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Optimum cutting temperature (OCT) compound	Agar Scientific	AGR1180
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Sequenza Rack	vwr	10129-584
Sodium Citrate	Fisher Scientific	S-279
Sucrose	Sigma	S9378
Triton X-100	Sigma	X100
Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate)	Corning	430769
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	1254