Minimalt invasive teknikker og et simpelt laboratorieudstyr forbedrer reproducerbarheden af rygmarvsskademodellen ved at reducere operativ skade på forsøgsdyrene og muliggøre anatomisk morfologivedligeholdelse. Metoden er umagen værd, fordi de pålidelige resultater og den reproducerbare procedure letter undersøgelserne af mekanismerne for sygdomserstatning.
Brug af minimalt invasive metoder til modellering af rygmarvsskade (SCI) kan minimere adfærdsmæssige og histologiske forskelle mellem forsøgsdyr og derved forbedre reproducerbarheden af forsøgene.
Disse metoder kræver to krav, der skal opfyldes: klarhed i den kirurgiske anatomiske vej og enkelhed og bekvemmelighed af laboratorieudstyret. Afgørende for operatøren giver en klar anatomisk vej minimalt invasiv eksponering, hvilket undgår yderligere skade på forsøgsdyret under de kirurgiske procedurer og gør det muligt for dyret at opretholde en konsistent og stabil anatomisk morfologi under eksperimentet.
I denne undersøgelse undersøges brugen af en ny integreret platform kaldet SCI koaksial platform til rygmarvsskade hos små dyr til at udsætte rygmarven på T9-niveau på en minimalt invasiv måde og stabilisere og immobilisere hvirvlen hos mus ved hjælp af en vertebral stabilisator, og endelig bruges en koaksial tyngdekraftpåvirkning til at kontaminere rygmarven hos mus til at nærme sig forskellige grader af T9 rygmarvsskade. Endelig gives histologiske resultater som reference for læserne.
Traumatisk rygmarvsskade (SCI) disponerer let individet for alvorlige konsekvenser1; Ikke desto mindre er der ingen effektiv behandling på nuværende tidspunkt 1,2. Kontusionsmodeller til dyr er en af de vigtigste metoder til undersøgelse af SCI 3,4.
Fra 2004 til 20144 blev rotter anvendt som modelorganismer i 289 ud af 407 undersøgelser (71 %) og mus i 69 (16,9 %). Faktisk er andelen af forsøg med mus gradvist steget gennem årene på grund af deres fordele i forhold til andre modeller, især det store potentiale for genreguleringsundersøgelser 3,4,5. Derfor er der behov for mere kompatible værktøjer til at gennemføre flere undersøgelser ved hjælp af musen som model på grund af den store betydning, der tillægges modelkonsistens6. De almindelige enheder, der er rapporteret i tidligere undersøgelser, er grundlæggende baseret på Allens rygmarvspåvirkningsprincip, for eksempel den grundlæggende vægtfaldsslagor7,8, New York University (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) slaglegeme1,9 og Infinite Horizon (IH) slaglegeme10,11 . Vægtfaldsstødlegemet og NYU/MASCIS slaglegemet deler det samme princip om at sigte mod den målrettede rygmarv og tabe en fast vægt fra forskellige højder for at gøre forskellige skadesalvorligheder. IH-slaglegemet skaber rygmarvsskaden i henhold til forskellige kræfter.
For nemheds skyld ved brug af musemodellen i SCI-undersøgelser og for at etablere grundlaget for effektive behandlingsmetoder udvikles en integreret platform for rygmarvsskade, kaldet spinal cord injury coaxial platform (SCICP). Platformen består af fire hovedkomponenter: (1) et operationsbord designet til en passende position for opererede mus, som er meget kompakt og giver bekvemmelighed uden positionsbegrænsning; 2) en mikroretraktor på begge sider til at holde paravertebrale muskler under drift (3) en vertebral stabilisator til at holde ryghvirvlen før proceduren for SCI (to vertebrale stabilisatorer er tilgængelige til operation på større dyr såsom rotter); (4) en ærme, en slaglegemespids, vægte og en trækstift. De tre dele skal samles til en aftagelig X-Y-Z-arm. For præcis målretning placeres en slaglegemespids på rygmarvens overflade, og X-Y-Z-armen sænkes forsigtigt ned til den forventede højde ved hjælp af mærket mellem slaglegemespidsen og bøsningen. Slaglegemespidsen er lavet af en 0,12 g aluminiumslegering for at undgå beskadigelse af rygmarven, der tilskrives stor vægtkompression før proceduren. Trækstiften er til at holde vægtene på toppen af ærmet for at forberede vægtfaldet (figur 1).
I tidligere undersøgelser blev slagkraftdeling defineret i henhold til IH-enhedens slagkraftdata, som er henholdsvis 30 Kdyn, 50 Kdyn og 70 Kdyn, 6,10. Under forskningsprocessen blev serielle grader af SCI-modeller bevist at være etableret baseret på SCICP, som kan bruges i forskellige undersøgelser. Derfor, før eksperimentet officielt startede, blev slagkræfterne genereret af forskellige vægte af forskellige masser testet ved hjælp af en toptrykprøvningsenhed. Som følge heraf blev tre standardiserede repræsentative SCI-musemodeller valgt som tre forskellige grader af skade, herunder graduerede milde, moderate og svære grupper, henholdsvis 6,10, og vægtene blev frigivet i samme højde med en vægt på 1,3 g for mild, 2,0 g for moderat og 2,7 g for alvorlig skade.
Som et andet middel til at garantere funktionsdygtighed og nøjagtighed rapporteres en ny og minimalt invasiv operativ tilgang. Ved at undersøge normale mus’ anatomi findes en ny metode til at lokalisere det interspinøse rum i T12-T13. Metoden til hvirvellokalisering i operationstrinnene er let at mestre og nøjagtig, hvilket sikrer præcis lokalisering til minimalt invasive operationer.
Forhåbentlig kan denne teknik til kontusionsskade hjælpe forskningen og forståelsen af rygmarvsskade, herunder patofysiologiforståelse, ledelsesevaluering og så videre.
Gennem den standardiserede procedure kan der opnås stabile data, især i små dyr in vivo-forsøg , hvilket kan minimere afvigelsen af resultater forårsaget af individuelle forskelle mellem dyrene. Baseret på ovenstående betingelser og praktiske applikationsinstrumenter kan der etableres standardiserede, minimalt invasive, nøjagtige og gentagelige SCI-modeller.
På grund af dets anvendelighed og bekvemmelighed blev vægtfaldspåvirkningen tidligere brugt mest3. Slaglegemet, der blev introduceret i denne undersøgelse, deler det samme princip med Allens model12. På grund af de nøjagtige produktionsfordele ved moderne bearbejdningsteknologi designede forskerholdet heldigvis en vægtfaldsslaglegeme med fordelene ved at være let at betjene, stærkt stabil og sjældent unøjagtig. En toptrykdetekteringsenhed blev brugt til at måle tyngdekraften af forskellige vægte. Tidligere undersøgelser6,10 om Infinite Horizons-slaglegemet rapporterede, at et kraftområde på ±5 Kdyn, der afviger fra den tilsigtede kraft, accepteres i grupperne 30 Kdyn, 50 Kdyn og 70 Kdyn, hvilket giver en reference for denne undersøgelse med hensyn til gruppedeling og valg af kontusionsgrad. I den nuværende forskning blev den mulige kraft af forskellige grupper målt på forhånd, og der blev opnået mere præcise data.
Mere kritisk end enheden i dyremodelforsøg er forståelsen og udnyttelsen af musens anatomi. At gøre god brug af anatomi kan gøre procedurer minimalt invasive. Minimalt invasiv kirurgi påvirker direkte stabiliteten af forsøgsdyrets funktionelle tilstand og konsistensen af efterfølgende musegendannelse. Tidligere undersøgelser har vist, at den minimalt invasive etablering af SCI-modeller øger stabiliteten af rygsøjlestrukturen og undgår yderligere skader forårsaget af spinal ustabilitet under genopretning hos rotter1. Forudsætningen for minimalt invasiv kirurgi er den rimelige anvendelse af naturlige anatomiske strukturer. Derfor bør hurtig og præcis lokalisering af rygmarvssegmenter ske i overensstemmelse med musens anatomiske struktur. Som rapporteret blev billeddannelsesmetoden brugt til at finde ryghvirvlen13. Selvom den har høj nøjagtighed, har billeddannelsesmetoden til lokalisering i den faktiske eksperimentelle driftsproces ulemperne ved ubelejlig drift, lang driftstid, kompleks udstyrsanskaffelse og høje krav til udstyrsnøjagtighed. McDonough et al. beskrev lokalisering af T7 gennem de ringere vinkler af scapulas14, mens mus virker i en løgneknæ, så de nævnte ringere vinkler formodes at være bageste vinkler. Desuden er brugen af de nedre scapular tips til at finde T7 en lokaliseringsmetode til en bestemt position i human anatomi15, som ikke er egnet til mus. Endelig validerede Micro-CT-data også hypotesen om, at scapulaens bageste vinkler ikke flugter med T7, uanset om musen er i deres naturlige eller specifikke kropsposition. McDonough et al.14 nævnte også at lokalisere det højeste punkt på ryggen, når musen er buet og definere det højeste punkt som T12. Til sammenligning er T9 i den nuværende forskning placeret ved hjælp af T12-T13 interspinøst rum, som hverken er forbundet med eller påvirket af musens kropsholdning. Desuden kan målhvirvlen med denne metode let lokaliseres og betjenes. Man skal sonde den 13. ribben under mikroskopet, forsigtigt røre området af costovertebralarvinklen, tegne en linje mod den spinøse proces og derefter sonde mellemrummet mellem de spinøse processer i T12-T13 mod hovedet. Forskerholdet brugte T12-T13 interspinous space til at lokalisere T9 på 12 mus. Endelig havde 12 kvindelige C57BL/6J-mus en mikro-CT-scanning efter T9-placeringen og laminektomi. Resultatet af Micro-CT-scanningen viste, at de fjernede laminer i alle 12 mus var T9. Resultaterne af Micro-CT viste, at alle T9 var nøjagtigt placeret, og nøjagtigheden var signifikant højere end scapula-lokaliseringsmetoden. Denne metode giver os en hurtig og præcis måde at lokalisere på, hvilket bidrager til konsistensen af skademodellen.
Den nuværende protokols minimale invasivitet er udtalt i hovedsageligt tre aspekter. For det første, efter lokalisering, trækkes paraspinalmusklerne på T9-niveau kun tilbage af mikroretraktorer uden at beskadige musklerne på T8- eller T10-niveauerne. Desuden forstyrrer eksponeringen af lamina af mikroretraktorerne ikke synsfeltet. For det andet er blodtab, som hovedsagelig skyldes laminektomi, som kan forårsage blodudstrømning fra den annullerede knogle, meget lavt i operationsproceduren, næsten ikke mere end volumenet til at plette et 2 mm x 2 mm x 3 mm trekantet stykke bomuld. For det tredje blev laminektomi udført begrænset til det nødvendige område i størst muligt omfang, idet kontinuiteten i den laterale del af lamina blev opretholdt og stærkt dæmpede hvirvelens ustabilitet. Sammenlignet med tidligere protokoller16,17 reducerer den nuværende protokol mange unødvendige skader.
For at evaluere de forskellige grader af SCI blev resultaterne mellem alle grupper i histopatologi sammenlignet med, hvad tidligere undersøgelser allerede har vist 9,11,18. Disse resultater er tilstrækkelige til at gennemføre en observationsundersøgelse af forskellige grader af skade og ændringer i forskellige perioder. HE og immunofluorescens viste, at med stigninger i sværhedsgraden af SCI fremkom mere unormal morfologi i rygmarvsvævet, og stigningen i graden af skade førte også til en stigning i graden af strukturel lidelse i rygmarven. Fra perspektivet af vævsmorfologiobservation er graden og regelmæssigheden af vævsmorfologiske ændringer i hver eksperimentel gruppe i denne undersøgelse meget konsistent med tidligere undersøgelser.
Ifølge de nuværende histologiske testresultater indikeres klare ændringer i forskellige indikatorer efter forskellige grader af traumatisk SCI, hvilket yderligere bekræfter pålideligheden af den model, der er etableret i denne undersøgelse.
Selvom teknikken er nøjagtig og effektiv, kan der være potentielle begrænsninger for metoderne. Med hensyn til laminektomi skal operatøren være dygtig med operationer under mikroskopet for at forhindre, at rygmarven beskadiges ved en fejltagelse. Opsætningen af hele platformen er også baseret på mekaniske strukturer, hvilket stiller større krav til operatøren sammenlignet med automatiseret udstyr. Faktisk kan alle de nævnte problemer forbedres ved gentagen træning af operationen.
Det kan ses, at minimalt invasiv og standardiseret modellering er gavnlig for at gøre resultaterne mere ensartede, stabile og gentagelige, evaluere effektiviteten af forskellige behandlingsplaner nøjagtigt og optimere forskningsplanen for traumatisk SCI.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af State Key Program of National Natural Science of China (81930070).
4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | abcam | ab8135 | Dilution ratio (1: 2000) |
Eosin Staining Solution (water soluble) | biosharp | BL727B | |
Ethanol | Fuyu Reagent | 64-17-5 | |
Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
Frozen Slicer | leica | CM3050 S | |
GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1: 600) |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1: 1000) |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1: 1000) |
Hematoxylin Staining Solution | biosharp | BL702A | |
Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
PBS (phosphate buffered solution) | Solarbio | P1020 | pH 7.2-7.4 |
RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | (https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1) |
Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
TBST (Tris Buffered Saline+Tween) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1: 19) |
Xylene | Fuyu Reagent | 1330-20-7 |