Sistemas CRISPR-Cas e proteínas anti-CRISPR foram integrados ao esquema de portões booleanos em Saccharomyces cerevisiae. Os novos circuitos lógicos pequenos mostraram bom desempenho e aprofundaram a compreensão dos fatores de transcrição baseados em dCas9/dCas12a e das propriedades das proteínas anti-CRISPR.
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Artigo de método
Circuitos Digitais Gênicos Baseados em Sistemas CRISPR-Cas e Proteínas Anti-CRISPR
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os portões booleanos de genes sintéticos e os circuitos digitais têm uma ampla gama de aplicações, desde diagnósticos médicos até cuidados ambientais. A descoberta dos sistemas CRISPR-Cas e seus inibidores naturais - as proteínas anti-CRISPR (Acrs) - fornece uma nova ferramenta para projetar e implementar circuitos digitais gênicos in vivo . Aqui, descrevemos um protocolo que segue a ideia do ciclo de engenharia biológica "Design-Build-Test-Learn" e faz uso de dCas9/dCas12a juntamente com seus Acrs correspondentes para estabelecer pequenas redes transcricionais, algumas das quais se comportam como portões booleanos, em Saccharomyces cerevisiae. Estes resultados apontam as propriedades de dCas9/dCas12a como fatores de transcrição. Em particular, para alcançar a ativação máxima da expressão gênica, dSpCas9 precisa interagir com um RNA de andaime projetado que coleta múltiplas cópias do domínio de ativação VP64 (AD). Em contraste, dCas12a deve ser fundido, no terminal C, com o forte VP64-p65-Rta (VPR) AD. Além disso, a atividade de ambas as proteínas Cas não é aumentada pelo aumento da quantidade de sgRNA/crRNA na célula. Este artigo também explica como criar portas booleanas com base na interação CRISPR-dCas-Acr. O domínio de ligação hormonal fundido AcrIIA4 do receptor de estrogênio humano é o núcleo de uma porta NOT responsiva ao β-estradiol, enquanto AcrVAs sintetizados pelo promotor induzível GAL1 permite imitar ambas as portas SIM e NÃO com galactose como entrada. Nos últimos circuitos, AcrVA5, juntamente com dLbCas12a, apresentou o melhor comportamento lógico.
Introdução
Em 2011, pesquisadores propuseram um método computacional e desenvolveram um software correspondente para o projeto automático de circuitos gênicos sintéticos digitais1. Um usuário tinha que especificar o número de entradas (três ou quatro) e preencher a tabela verdade do circuito; Isso forneceu todas as informações necessárias para derivar a estrutura do circuito usando técnicas da eletrônica. A tabela verdade foi traduzida em duas fórmulas booleanas através do método do mapa de Karnaugh2. Cada fórmula booleana é feita de cláusulas que descrevem operações lógicas (soma ou multiplicação) entre (parte de) as entr....
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Protocolo
1. Projeto e construção do de expressão de sgRNA/crRNA
NOTA: Existem dois tipos de de expressão de sgRNA/crRNA: um denominado SNR5210-é composto pelo promotor SNR52 dependente de RNA polimerase III, a sequência sgRNA/crRNA e o terminador SUP4; outra, abreviada como RGR11, consiste no promotor ADH1 dependente de RNA polimerase II, a estrutura RGR (ribozima-guia RNA-ribozima) que contém duas ribozimas (uma ribozima-HH e uma ribozima-HDV do vírus delta da hepatite) e a sequência do sgRNA/crRNA intermediário e o terminador ADH1. Os homólogos Cas9 ....
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Resultados
Expressão de sgRNA/crRNA por um promotor do tipo RNA polimerase III
Primeiramente, este trabalho abordou a engenharia do circuito de ativação transcricional (circuito 1) mostrado na Figura 1A. Ele continha três componentes básicos: 1) o gene que codifica para yEGFP (o repórter), que foi precedido por uma série de diferentes promotores sintéticos que forneceram locais-alvo para dCas9/dCas12a-AD; 2) uma versão otimizada para códons de levedura de dCas9 ou dCas12a fusionada .......
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Discussão
O protocolo mostrou um possível fluxo de trabalho completo para circuitos digitais de genes sintéticos, seguindo o ciclo de engenharia biológica "Design-Build-Test-Learn" (DBTL) e em experimentos de laboratório seco e úmido. Aqui, nós nos concentramos no sistema CRISPR-Cas, principalmente dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a, e as proteínas anti-CRISPR correspondentes, projetando e construindo em S. cerevisiae pequenas redes transcricionais. Alguns deles imitavam portões booleanos, que são os componentes básicos dos .......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesse financeiro concorrente.
Agradecimentos
Queremos agradecer a todos os alunos do laboratório de Biologia Sintética - SPST, TJU - por sua ajuda geral, juntamente com Zhi Li e Xiangyang Zhang por sua assistência em experimentos FACS.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de PCR de 8 tiras de 0,1 mL | NEST | 403112 | |
| Tubos de PCR de 0,2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Microtubos de 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| Tubos de centrífuga de 15 mL | BIOFIL | CFT011150 | |
| Microtubos de 2 mL | Axygen | MCT-200-C | |
| Tubos de centrífuga de 50 mL | BIOFIL | CFT011500 | |
| Grau de biologia molecular de agarose | Invitrogen | 75510-019 | |
| Sal de ampicilina sódica | Solarbio | 69-52-3 | |
| Aplicada biosystems veriti Termociclador de 96 poços | Thermo Fisher Scientific | 4375786 | |
| AxyPrep Kit de extração de gel de DNA | Axygen | AP-GX-250 | |
| BD FACSuite CS& AMP; T grânulos de pesquisa | BD | 650621 | Fluorescente |
| BD FACSCotômetro de fluxo de verse | BD-Centrifuge | ||
| Eppendorf | 5424 | ||
| Centrífuga Sorvall ST 16R | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | |
| E. coli células competentes (Cepa DH5α) | Life Technologies | 18263-012 | |
| ECL selecionar Western Blotting reagente de detecção | GE Healthcare | RPN2235 | |
| aparelho de eletroforese | Beijing JUNYI Electrophoresis Co., Ltd | JY300C | |
| Flat 8-strip caps | NEST | 406012 | |
| empresa de síntese de genes | Azenta Life Sciences | https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences | |
| Anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG (H+L) de cabra anti-camundongo Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | |
| HiFiScript kit de síntese de cDNA | CWBIO | CW2569M | usado na etapa 6.2.2.1 |
| Solução de lisado (Zymolyase) | zymoresearch | E1004-A | |
| Microscópio de fluorescência Nikon Eclipse 80i | Nikon | - | Microscópio de fluorescência |
| Pontas de pipete— 10 μ L | Axygen | T-300-R-S | |
| Pontas de pipeta— 1000 μ L | Axygen | T-1000-B-R-S | |
| Pontas de pipeta— 200 μ L | Axygen | T-200-Y-R-S | |
| pRSII403 | Addgene | 35436 | |
| pRSII404 | Addgene | 35438 | |
| pRSII405 | Addgene | 35440 | |
| pRSII406 | Addgene | 35442 | |
| pRSII424 | Addgene | 35466 | |
| pTPGI_dSpCas9_VP64 | Addgene | 49013 | |
| Q5 DNApolimerase de alta fidelidade | New England Biolabs | M0491 | |
| Enzima de restrição-Acc65I | New England Biolabs | R0599 | |
| Enzima de restrição-BamHI | New England Biolabs | R0136 | |
| Enzima de restrição-SacI-HF | New England Biolabs | R3156 | |
| Enzima de restrição-XhoI | New England Biolabs | R0146 | |
| Roche LightCycler 96 | de | PCR em tempo real | Roche |
| S. cerevisiae CEN. PK2-1C | - | A cepa original. O genótipo é: MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; TRP1-289; MAL2-8c; Kit de | |
| alça de haste | SparkJade | AG0502 | Kit usado na etapa 6.2.1.3 |
| Termociclador T100 | BIO-RAD | 186-1096 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
| T5 Exonuclease | New England Biolabs | M0363 | |
| Taq DNA ligase | New England Biolabs | M0208 | |
| Taq DNA polimerase | New England Biolabs | M0495 | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye) | Takara | RR820Q | |
| YeaStar RNA kit | Zymo Research | R1002 | |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E8875 |
Referências
- Marchisio, M. A., Stelling, J. Automatic design of digital synthetic gene circuits. PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083(2011).
- Karnaugh, M. The map method for synthesis of combinational logic circuits. Transactions of the Ameri....
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Reimpressões e permissões
