הערכת התכונות האנטי-קריפטוקוקליות המשוערות של תמציות גולמיות ומזוקקות מרכיכות
Summary
הפתוגן הפטרייתי האנושי Cryptococcus neoformans מייצר מגוון גורמים אלימים (למשל, פפטידאזות) כדי לקדם את הישרדותו בתוך הפונדקאי. נישות סביבתיות מייצגות מקור מבטיח של מעכבי פפטידאז טבעיים חדשים. פרוטוקול זה מתאר את הכנת התמציות מרכיכות ואת הערכת השפעתן על ייצור גורמי אלימות פטרייתיים.
Abstract
Cryptococcus neoformans הוא פתוגן פטרייתי אנושי עטוף עם תפוצה עולמית המדביקה בעיקר אנשים מדוכאי חיסון. השימוש הנרחב בתרופות אנטי-פטרייתיות במסגרות קליניות, השימוש בהן בחקלאות והכלאת זנים הובילו לאבולוציה מוגברת של עמידות. שיעור עולה זה של עמידות נגד אנטי פטרייתיות הוא דאגה גוברת בקרב רופאים ומדענים ברחבי העולם, ויש דחיפות מוגברת לפתח טיפולים אנטי פטרייתיים חדשניים. לדוגמה, C. neoformans מייצר מספר גורמי אלימות, כולל אנזימים תוך-תאיים וחוץ-תאיים (למשל, פפטידאזות) עם תפקידים בפירוק רקמות, ויסות תאי ורכישת חומרים מזינים. ההפרעה לפעילות פפטידאז כזו על ידי מעכבים מפריעה לגדילה ולשגשוג של פטריות, מה שמרמז על כך שזו עשויה להיות אסטרטגיה חשובה למאבק בפתוגן. חשוב לציין, חסרי חוליות כגון רכיכות מייצרים מעכבי פפטידאז עם יישומים ביו-רפואיים ופעילות אנטי-מיקרוביאלית, אך הם אינם נחקרים מספיק במונחים של השימוש בהם נגד פתוגנים פטרייתיים. בפרוטוקול זה, בוצע מיצוי גלובלי מרכיכות כדי לבודד מעכבי פפטידאז פוטנציאליים בתמציות גולמיות ומזוקקות, והוערכו השפעתם נגד גורמי אלימות קריפטוקוקליים קלאסיים. שיטה זו תומכת בתעדוף רכיכות בעלות תכונות אנטי פטרייתיות ומספקת הזדמנויות לגילוי חומרים אנטי-אלימים על ידי רתימת המעכבים הטבעיים הנמצאים ברכיכות.
Introduction
Cryptococcus neoformans הוא פתוגן פטרייתי אנושי המייצר מחלה קשה אצל מארחים מדוכאי חיסון, כגון אנשים החיים עם HIV / איידס1, ומוביל לכ -19% ממקרי המוות הקשורים לאיידס2. הפטרייה רגישה למספר סוגים של אנטי פטרייתיות, כולל אזולים, פולינים ופלוציטוזין, המפעילים פעילות קוטלת פטריות ופטריות באמצעות מנגנונים נפרדים 3,4. עם זאת, השימוש הנרחב באנטי-פטרייתיות בסביבה קלינית וחקלאית בשילוב עם הכלאת זנים הגבירו את התפתחות העמידות במינים פטרייתיים רבים, כולל C. neoformans5.
כדי להתגבר על האתגרים של עמידות נגד פטריות ולהפחית את השכיחות של זיהומים פטרייתיים בקנה מידה עולמי, גישה מבטיחה היא להשתמש בגורמי האלימות של Cryptococcus spp. (למשל, יכולת הסתגלות לטמפרטורה, כמוסה רב-סוכרית, מלנין ואנזימים חוץ-תאיים) כמטרות טיפוליות פוטנציאליות 4,6 . לגישה זו מספר יתרונות, שכן גורמי אלימות אלה מאופיינים היטב בספרות, ומיקוד גורמים אלה עשוי להפחית את שיעורי העמידות האנטי פטרייתית על ידי הטלת לחץ סלקטיבי חלש יותר באמצעות פגיעה באלימות במקום להתמקד בצמיחת תאים6. בהקשר זה, מחקרים רבים העריכו את האפשרות להתמקד באנזימים חוץ-תאיים (למשל, פרוטאזות, פפטידאזות) כדי להפחית או לעכב את האלימות של Cryptococcus spp.7,8,9.
לאורגניזמים כמו חסרי חוליות וצמחים אין מערכת חיסון נרכשת שתגן על עצמם מפני פתוגנים. עם זאת, הם מסתמכים על מערכת חיסון מולדת חזקה עם מגוון עצום של תרכובות כימיות כדי להתמודד עם מיקרואורגניזמים וטורפים10. מולקולות אלה כוללות מעכבי פפטידאז, הממלאים תפקידים חשובים במערכות ביולוגיות רבות, כולל תהליכים תאיים של חסינות חסרי חוליות, כגון קרישה של המולימפה, סינתזה של ציטוקינים ופפטידים אנטי-מיקרוביאליים, והגנה על פונדקאים על ידי השבתה ישירה של פרוטאזות של פתוגנים11. לפיכך, מעכבי פפטידאז מחסרי חוליות כגון רכיכות הם בעלי יישומים ביו-רפואיים פוטנציאליים, אך רבים מהם נותרים בלתי מאופיינים10,12,13. בהקשר זה, ישנם כ-34 מינים של רכיכות יבשתיות באונטריו ו-180 רכיכות מים מתוקים בקנדה14. עם זאת, הפרופיל והאפיון המעמיקים שלהם עדיין מוגבלים15. אורגניזמים אלה מהווים הזדמנות לזיהוי תרכובות חדשות בעלות פעילות אנטי-פטרייתית פוטנציאלית10.
בפרוטוקול הזה מתוארות שיטות לבודד ולהבהיר תמציות מחסרי חוליות (למשל רכיכות) (איור 1), ולאחר מכן למדוד את הפעילות המעכבת המשוערת של הפפטידאז. לאחר מכן מעריכים את התכונות האנטי-פטרייתיות של התמציות האלה על-ידי מדידת ההשפעה שלהן על ייצור פקטורי אלימות של C. neoformans באמצעות בדיקות פנוטיפיות (איור 2). חשוב לציין כי הבדלים בתכונות האנטי-פטרייתיות בין תמציות גולמיות ומזוקקות עשויים להצביע על גורמים מיקרוביאליים (למשל, מטבוליטים משניים או רעלנים המיוצרים על-ידי המיקרוביום המארח) של הרכיכה, אשר עשויים להשפיע על תצפיות ניסיוניות. ממצאים אלה תומכים בצורך של פרוטוקול זה להעריך תמציות גולמיות והבהרות באופן עצמאי כדי לפענח את דרכי הפעולה. בנוסף, תהליך המיצוי אינו מוטה ועשוי לאפשר זיהוי תכונות מיקרוביאליות כנגד שפע של פתוגנים פטרייתיים וחיידקיים. לכן, פרוטוקול זה מספק נקודת התחלה לתעדוף מיני רכיכות בעלות תכונות אנטי-פטרייתיות כנגד C. neoformans והזדמנות להעריך את הקשרים בין פעילות אנזימטית לייצור גורמי אלימות באמצעות מנגנוני עיכוב משוערים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול המיצוי המתואר כאן מתאר את בידוד התרכובות מרכיכות שנאספו מאונטריו, קנדה, ומדגים מחקר חדשני של שימוש בתמציות רכיכות נגד הפתוגן הפטרייתי האנושי, C. neoformans. פרוטוקול זה מתווסף לגוף הולך וגדל של מחקרים החוקרים פעילות מעכבי פפטידאז מחסרי חוליות13. במהלך המיצוי, חלק מדגי?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לחברי מעבדת גדס-מקאליסטר על תמיכתם רבת הערך לאורך כל החקירה ועל המשוב שלהם על כתבי היד. המחברים מודים על תמיכת המימון של מלגת אונטריו לתארים מתקדמים ופרס המחקר הבינלאומי לתארים מתקדמים – אוניברסיטת גואלף ל- D. G.-G ומהקרן הקנדית לחדשנות (JELF 38798) ומשרד המכללות והאוניברסיטאות של אונטריו – פרס החוקר המוקדם עבור J. G.-M.
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
Referências
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S., Werger, M. J. A. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. , 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. . Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , (2013).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
