Vurdere de antatte antikryptokokkegenskapene til råolje og klargjorte ekstrakter fra bløtdyr
Summary
Det humane sopppatogenet Cryptococcus neoformans produserer en rekke virulensfaktorer (f.eks. Peptidaser) for å fremme overlevelse i verten. Miljønisjer representerer en lovende kilde til nye naturlige peptidasehemmere. Denne protokollen skisserer fremstilling av ekstrakter fra bløtdyr og vurderingen av deres effekt på soppvirulensfaktorproduksjon.
Abstract
Cryptococcus neoformans er et innkapslet humant sopppatogen med en global distribusjon som primært infiserer immunkompromitterte individer. Den utbredte bruken av antifungale midler i kliniske omgivelser, deres bruk i landbruket og stammehybridisering har ført til økt utvikling av resistens. Denne økende graden av resistens mot antifungale midler er en økende bekymring blant klinikere og forskere over hele verden, og det er økt haster med å utvikle nye antifungale terapier. For eksempel produserer C. neoformans flere virulensfaktorer, inkludert intra- og ekstracellulære enzymer (f.eks. Peptidaser) med roller i vevsnedbrytning, cellulær regulering og næringsoppkjøp. Forstyrrelsen av slik peptidaseaktivitet av inhibitorer forstyrrer soppvekst og spredning, noe som tyder på at dette kan være en viktig strategi for å bekjempe patogenet. Det er viktig at hvirvelløse dyr som bløtdyr produserer peptidasehemmere med biomedisinske anvendelser og antimikrobiell aktivitet, men de er underutforsket når det gjelder bruk mot sopppatogener. I denne protokollen ble det utført en global ekstraksjon fra bløtdyr for å isolere potensielle peptidasehemmere i rå og klargjorte ekstrakter, og deres effekter mot klassiske kryptokokkvirulensfaktorer ble vurdert. Denne metoden støtter prioriteringen av bløtdyr med antifungale egenskaper og gir muligheter for oppdagelse av antivirulensmidler ved å utnytte de naturlige hemmere som finnes i bløtdyr.
Introduction
Cryptococcus neoformans er et humant sopppatogen som produserer alvorlig sykdom hos immunkompromitterte verter, for eksempel personer som lever med HIV / AIDS1, og fører til omtrent 19% av AIDS-relaterte dødsfall2. Svampen er utsatt for flere klasser av antifungale midler, inkludert azoler, polyener og flucytosin, som utøver soppdrepende og fungistatisk aktivitet ved hjelp av forskjellige mekanismer 3,4. Imidlertid har den omfattende bruken av antifungale midler i kliniske og landbruksinnstillinger kombinert med stammehybridisering forsterket utviklingen av resistens i flere sopparter, inkludert C. neoformans5.
For å overvinne utfordringene med antifungal resistens og redusere forekomsten av soppinfeksjoner på global skala, er en lovende tilnærming å bruke virulensfaktorene til Cryptococcus spp. (f.eks. Temperaturtilpasningsevne, polysakkaridkapsel, melanin og ekstracellulære enzymer) som potensielle terapeutiske mål 4,6 . Denne tilnærmingen har flere fordeler, da disse virulensfaktorene er godt karakterisert i litteraturen, og målretting av disse faktorene kan potensielt redusere frekvensen av antifungal resistens ved å pålegge et svakere selektivt trykk gjennom å svekke virulens i stedet for å målrette cellevekst6. I denne sammenheng har mange studier vurdert muligheten for å målrette ekstracellulære enzymer (f.eks. Proteaser, peptidaser) for å redusere eller hemme virulensen av Cryptococcus spp.7,8,9.
Organismer som virvelløse dyr og planter har ikke et adaptivt immunsystem for å beskytte seg mot patogener. Imidlertid er de avhengige av et sterkt medfødt immunsystem med et enormt utvalg av kjemiske forbindelser for å håndtere mikroorganismer og rovdyr10. Disse molekylene inkluderer peptidasehemmere, som spiller viktige roller i mange biologiske systemer, inkludert de cellulære prosessene for hvirvelløse immuniteter, slik som koagulering av hemolymfe, syntese av cytokiner og antimikrobielle peptider og beskyttelse av verter ved direkte inaktivering av proteasene av patogener11. Dermed har peptidasehemmere fra virvelløse dyr som bløtdyr potensielle biomedisinske anvendelser, men mange forblir ukarakteriserte10,12,13. I denne sammenheng er det omtrent 34 arter av terrestriske bløtdyr i Ontario og 180 ferskvannsbløtdyr i Canada14. Imidlertid er deres grundige profilering og karakterisering fortsatt begrenset15. Disse organismene gir en mulighet for identifisering av nye forbindelser med potensiell anti-soppaktivitet10.
I denne protokollen er metoder for å isolere og klargjøre ekstrakter fra virvelløse dyr (f.eks. bløtdyr) (figur 1) etterfulgt av måling av antatt peptidasehemmende aktivitet beskrevet. De antifungale egenskapene til disse ekstraktene vurderes deretter ved å måle deres innvirkning på C. neoformans virulensfaktorproduksjon ved hjelp av fenotypiske analyser (figur 2). Det er viktig å merke seg at forskjeller i antifungale egenskaper mellom rå og klargjorte ekstrakter kan være indikative for mikrobielle faktorer (f.eks. sekundære metabolitter eller toksiner produsert av vertsmikrobiomet) av bløtdyret, noe som kan påvirke eksperimentelle observasjoner. Slike funn støtter behovet for denne protokollen for å vurdere både grove og klargjorte ekstrakter uavhengig for å avdekke virkemåtene. I tillegg er ekstraksjonsprosessen objektiv og kan muliggjøre påvisning av antimikrobielle egenskaper mot en mengde sopp- og bakteriepatogener. Derfor gir denne protokollen et initieringspunkt for prioritering av bløtdyrarter med antifungale egenskaper mot C. neoformans og en mulighet til å evaluere sammenhengen mellom enzymatisk aktivitet og virulensfaktorproduksjon gjennom antatte hemmende mekanismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ekstraksjonsprotokollen beskrevet her skisserer isoleringen av forbindelser fra bløtdyr samlet fra Ontario, Canada, og demonstrerer en ny undersøkelse av bruk av bløtdyrekstrakter mot det humane sopppatogenet, C. neoformans. Denne protokollen legger til en voksende forskningsgruppe som undersøker peptidasehemmeraktivitet fra virvelløse dyr13. Under ekstraksjonen var noen ekstraktprøver vanskelige å filtrere, muligens på grunn av tilstedeværelsen av løselige polysakkarider og / e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker medlemmer av Geddes-McAlister Lab for deres verdifulle støtte gjennom denne undersøkelsen og deres tilbakemeldinger fra manuskriptet. Forfatterne anerkjenner finansieringsstøtten fra Ontario Graduate Scholarship og International Graduate Research Award – University of Guelph til DG og fra Canadian Foundation of Innovation (JELF 38798) og Ontario Ministry of Colleges and Universities – Early Researcher Award for JG-M.
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
Referências
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S., Werger, M. J. A. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. , 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. . Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , (2013).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
