Avaliando as Propriedades Anticriptocócicas Putativas de Extratos Brutos e Clarificados de Moluscos
Summary
O patógeno fúngico humano Cryptococcus neoformans produz uma variedade de fatores de virulência (por exemplo, peptidases) para promover sua sobrevivência dentro do hospedeiro. Os nichos ambientais representam uma fonte promissora de novos inibidores naturais da peptidase. Este protocolo descreve a preparação de extratos de moluscos e a avaliação do seu efeito na produção do fator de virulência fúngica.
Abstract
Cryptococcus neoformans é um patógeno fúngico humano encapsulado com uma distribuição global que infecta principalmente indivíduos imunocomprometidos. O uso generalizado de antifúngicos em ambientes clínicos, seu uso na agricultura e hibridização de cepas levaram ao aumento da evolução da resistência. Esta crescente taxa de resistência contra antifúngicos é uma preocupação crescente entre clínicos e cientistas em todo o mundo, e há uma maior urgência em desenvolver novas terapias antifúngicas. Por exemplo, C. neoformans produz vários fatores de virulência, incluindo enzimas intra e extracelulares (por exemplo, peptidases) com papéis na degradação tecidual, regulação celular e aquisição de nutrientes. A interrupção da atividade dessa peptidase por inibidores perturba o crescimento e a proliferação de fungos, sugerindo que esta pode ser uma estratégia importante para o combate ao patógeno. É importante ressaltar que invertebrados, como moluscos, produzem inibidores da peptidase com aplicações biomédicas e atividade antimicrobiana, mas são pouco explorados em termos de seu uso contra patógenos fúngicos. Neste protocolo, uma extração global de moluscos foi realizada para isolar potenciais inibidores da peptidase em extratos brutos e clarificados, e seus efeitos contra fatores clássicos de virulência criptocócica foram avaliados. Este método suporta a priorização de moluscos com propriedades antifúngicas e oferece oportunidades para a descoberta de agentes antivirulência, aproveitando os inibidores naturais encontrados em moluscos.
Introduction
Cryptococcus neoformans é um patógeno fúngico humano que produz doença grave em hospedeiros imunocomprometidos, como indivíduos vivendo com HIV/AIDS1, e leva a aproximadamente 19% das mortes relacionadas à AIDS2. O fungo é suscetível a várias classes de antifúngicos, incluindo azóis, polienos e flucitosina, que exercem atividade fungicida e fungistática utilizando mecanismos distintos 3,4. No entanto, o uso extensivo de antifúngicos em ambientes clínicos e agrícolas, combinado com a hibridização de cepas, amplificou a evolução da resistência em múltiplas espécies de fungos, incluindo C. neoformans5.
Para superar os desafios da resistência antifúngica e reduzir a prevalência de infecções fúngicas em escala global, uma abordagem promissora é usar os fatores de virulência de Cryptococcus spp. (por exemplo, adaptabilidade à temperatura, cápsula de polissacarídeos, melanina e enzimas extracelulares) como potenciais alvos terapêuticos 4,6 . Essa abordagem tem várias vantagens, pois esses fatores de virulência estão bem caracterizados na literatura, e direcionar esses fatores poderia potencialmente reduzir as taxas de resistência antifúngica, impondo uma pressão seletiva mais fraca por meio da virulência prejudicada, em vez de visar o crescimento celular6. Nesse contexto, inúmeros estudos têm avaliado a possibilidade de direcionar enzimas extracelulares (por exemplo, proteases, peptidases) para reduzir ou inibir a virulência de Cryptococcus spp.7,8,9.
Organismos como invertebrados e plantas não possuem um sistema imunológico adaptativo para se proteger de patógenos. No entanto, eles dependem de um forte sistema imunológico inato com uma imensa variedade de compostos químicos para lidar com micro-organismos e predadores10. Essas moléculas incluem inibidores de peptidase, que desempenham papéis importantes em muitos sistemas biológicos, incluindo os processos celulares da imunidade de invertebrados, como a coagulação da hemolinfa, a síntese de citocinas e peptídeos antimicrobianos e a proteção dos hospedeiros pela inativação direta das proteases de patógenos11. Assim, inibidores de peptidases de invertebrados, como moluscos, possuem potenciais aplicações biomédicas, mas muitos permanecem descaracterizados10,12,13. Neste contexto, existem aproximadamente 34 espécies de moluscos terrestres em Ontário e 180 moluscos de água doce no Canadá14. No entanto, seu perfil e caracterização aprofundados ainda são limitados15. Esses organismos apresentam uma oportunidade para a identificação de novos compostos com potencial atividade antifúngica10.
Neste protocolo, são descritos métodos para isolar e esclarecer extratos de invertebrados (por exemplo, moluscos) (Figura 1) seguidos da medição da atividade inibitória da peptidase putativa. As propriedades antifúngicas desses extratos são então avaliadas medindo-se seu impacto na produção do fator de virulência de C. neoformans por meio de ensaios fenotípicos (Figura 2). É importante notar que as diferenças nas propriedades antifúngicas entre extratos brutos e clarificados podem ser indicativas de fatores microbianos (por exemplo, metabólitos secundários ou toxinas produzidas pelo microbioma hospedeiro) do molusco, o que pode influenciar as observações experimentais. Tais achados reforçam a necessidade de este protocolo avaliar extratos brutos e clarificados de forma independente para desvendar os modos de ação. Além disso, o processo de extração é imparcial e pode permitir a detecção de propriedades antimicrobianas contra uma infinidade de patógenos fúngicos e bacterianos. Portanto, este protocolo fornece um ponto de iniciação para a priorização de espécies de moluscos com propriedades antifúngicas contra C. neoformans e uma oportunidade para avaliar as conexões entre a atividade enzimática e a produção do fator de virulência através de mecanismos inibitórios putativos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo de extração descrito aqui descreve o isolamento de compostos de moluscos coletados de Ontário, Canadá, e demonstra uma nova investigação do uso de extratos de moluscos contra o patógeno fúngico humano, C. neoformans. Esse protocolo se soma a um crescente corpo de pesquisas que investigam a atividade inibidora da peptidase a partir de invertebrados13. Durante a extração, algumas amostras de extrato foram de difícil filtragem-esterilização, possivelmente devido à p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem aos membros do Laboratório Geddes-McAlister por seu valioso apoio ao longo desta investigação e seu feedback do manuscrito. Os autores reconhecem o apoio financeiro da Ontario Graduate Scholarship e International Graduate Research Award – University of Guelph para D. G.-G e da Canadian Foundation of Innovation (JELF 38798) e Ontario Ministry of Colleges and Universities – Early Researcher Award for J. G.-M.
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
Referências
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