Оценка предполагаемых антикриптококковых свойств сырых и осветленных экстрактов моллюсков
Summary
Человеческий грибковый патоген Cryptococcus neoformans продуцирует различные факторы вирулентности (например, пептидазы), способствующие его выживанию в организме хозяина. Экологические ниши представляют собой многообещающий источник новых природных ингибиторов пептидазы. В этом протоколе описывается приготовление экстрактов из моллюсков и оценка их влияния на выработку фактора вирулентности грибов.
Abstract
Cryptococcus neoformans – это инкапсулированный грибковый патоген человека с глобальным распространением, который в основном заражает людей с ослабленным иммунитетом. Широкое использование противогрибковых препаратов в клинических условиях, их использование в сельском хозяйстве и гибридизация штаммов привели к увеличению эволюции резистентности. Этот растущий уровень резистентности к противогрибковым препаратам вызывает растущую озабоченность среди клиницистов и ученых во всем мире, и существует повышенная необходимость в разработке новых противогрибковых методов лечения. Например, C. neoformans продуцирует несколько факторов вирулентности, включая внутри- и внеклеточные ферменты (например, пептидазы), играющие роль в деградации тканей, клеточной регуляции и усвоении питательных веществ. Нарушение такой пептидазной активности ингибиторами нарушает рост и пролиферацию грибов, предполагая, что это может быть важной стратегией борьбы с патогеном. Важно отметить, что беспозвоночные, такие как моллюски, продуцируют ингибиторы пептидазы с биомедицинским применением и антимикробной активностью, но они недостаточно изучены с точки зрения их использования против грибковых патогенов. В этом протоколе была проведена глобальная экстракция из моллюсков для выделения потенциальных ингибиторов пептидазы в сырых и осветленных экстрактах, и было оценено их влияние на классические факторы вирулентности криптококка. Этот метод поддерживает приоритет моллюсков с противогрибковыми свойствами и предоставляет возможности для открытия противовирулентных агентов за счет использования природных ингибиторов, обнаруженных в моллюсках.
Introduction
Cryptococcus neoformans — это грибковый патоген человека, который вызывает тяжелое заболевание у хозяев с ослабленным иммунитетом, таких как люди, живущие с ВИЧ/СПИДом1, и приводит примерно к 19% смертей, связанных соСПИДом2. Гриб чувствителен к нескольким классам противогрибковых препаратов, включая азолы, полиены и флуцитозин, которые проявляют фунгицидную и фунгистатическую активность с использованием различных механизмов 3,4. Однако широкое использование противогрибковых препаратов в клинических и сельскохозяйственных условиях в сочетании с гибридизацией штаммов усилило эволюцию резистентности у нескольких видов грибов, включая C. neoformans5.
Для преодоления проблем устойчивости к противогрибковым препаратам и снижения распространенности грибковых инфекций в глобальном масштабе перспективным подходом является использование факторов вирулентности Cryptococcus spp. (например, температурной адаптивности, полисахаридной капсулы, меланина и внеклеточных ферментов)в качестве потенциальных терапевтических мишеней 4,6 . Этот подход имеет ряд преимуществ, поскольку эти факторы вирулентности хорошо охарактеризованы в литературе, и нацеливание на эти факторы может потенциально снизить показатели устойчивости к противогрибковым препаратам, оказывая более слабое селективное давление за счет ухудшения вирулентности, а не нацеливания на рост клеток6. В этом контексте многочисленные исследования оценили возможность воздействия на внеклеточные ферменты (например, протеазы, пептидазы) для снижения или ингибирования вирулентности Cryptococcus spp.7,8,9.
Такие организмы, как беспозвоночные и растения, не обладают адаптивной иммунной системой, чтобы защитить себя от патогенов. Тем не менее, они полагаются на сильную врожденную иммунную систему с огромным количеством химических соединений для борьбы с микроорганизмами и хищниками10. Эти молекулы включают ингибиторы пептидаз, которые играют важную роль во многих биологических системах, включая клеточные процессы иммунитета беспозвоночных, такие как коагуляция гемолимфы, синтез цитокинов и антимикробных пептидов, а также защита хозяев путем прямой инактивации протеаз патогенов11. Таким образом, ингибиторы пептидазы беспозвоночных, таких как моллюски, обладают потенциальными биомедицинскими применениями, но многие из них остаются неохарактеризованными10,12,13. В этом контексте насчитывается около 34 видов наземных моллюсков в Онтарио и 180 пресноводных моллюсков в Канаде14. Однако их углубленное профилирование и характеристика по-прежнему ограничены15. Эти организмы предоставляют возможность для идентификации новых соединений с потенциальной противогрибковой активностью10.
В этом протоколе описаны методы выделения и осветления экстрактов беспозвоночных (например, моллюсков) (рис. 1) с последующим измерением предполагаемой ингибирующей активности пептидазы. Затем противогрибковые свойства этих экстрактов оценивают путем измерения их влияния на продукцию фактора вирулентности C. neoformans с использованием фенотипических анализов (рис. 2). Важно отметить, что различия в противогрибковых свойствах между сырыми и осветленными экстрактами могут указывать на микробные факторы (например, вторичные метаболиты или токсины, продуцируемые микробиомом хозяина) моллюска, которые могут влиять на экспериментальные наблюдения. Такие результаты подтверждают необходимость того, чтобы этот протокол независимо оценивал как сырые, так и осветленные экстракты, чтобы разгадать способы действия. Кроме того, процесс экстракции является объективным и может позволить обнаружить антимикробные свойства против множества грибковых и бактериальных патогенов. Таким образом, этот протокол обеспечивает отправную точку для определения приоритета видов моллюсков с противогрибковыми свойствами против C. neoformans и возможность оценить связи между ферментативной активностью и продукцией фактора вирулентности с помощью предполагаемых ингибирующих механизмов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь протокол экстракции описывает выделение соединений из моллюсков, собранных в Онтарио, Канада, и демонстрирует новое исследование использования экстрактов моллюсков против грибкового патогена человека C. neoformans. Этот протокол дополняет растущий объем исследований…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят членов лаборатории Геддеса-Макалистера за их ценную поддержку на протяжении всего исследования и отзывы о рукописях. Авторы выражают признательность за финансовую поддержку со стороны Ontario Graduate Scholarship and International Graduate Research Award – University of Guelph to D.G.-G, а также от Канадского фонда инноваций (JELF 38798) и Министерства колледжей и университетов Онтарио – Early Research Award для J.G.-M.
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
Referências
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S., Werger, M. J. A. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. , 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. . Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , (2013).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
