Bedömning av de förmodade antikryptokockegenskaperna hos råa och klarade extrakt från blötdjur
Summary
Den humana svamppatogenen Cryptococcus neoformans producerar en mängd olika virulensfaktorer (t.ex. peptidaser) för att främja dess överlevnad inom värden. Miljönischer utgör en lovande källa till nya naturliga peptidashämmare. I detta protokoll beskrivs beredningen av extrakt från blötdjur och bedömningen av deras effekt på produktionen av svampvirulensfaktor.
Abstract
Cryptococcus neoformans är en inkapslad mänsklig svamppatogen med en global distribution som främst infekterar immunsupprimerade individer. Den utbredda användningen av antimykotika i kliniska miljöer, deras användning inom jordbruket och stamhybridisering har lett till ökad resistensutveckling. Denna ökande resistens mot antimykotika är ett växande problem bland kliniker och forskare över hela världen, och det finns ökad brådska att utveckla nya svampdödande terapier. Till exempel producerar C. neoformans flera virulensfaktorer, inklusive intra- och extracellulära enzymer (t.ex. peptidaser) med roller i vävnadsnedbrytning, cellulär reglering och näringsförvärv. Störningen av sådan peptidasaktivitet av hämmare stör svamptillväxt och proliferation, vilket tyder på att detta kan vara en viktig strategi för att bekämpa patogenen. Det är viktigt att ryggradslösa djur som blötdjur producerar peptidashämmare med biomedicinska tillämpningar och antimikrobiell aktivitet, men de är underutforskade när det gäller deras användning mot svamppatogener. I detta protokoll utfördes en global extraktion från blötdjur för att isolera potentiella peptidashämmare i råa och klarade extrakt, och deras effekter mot klassiska kryptokockvirulensfaktorer utvärderades. Denna metod stöder prioriteringen av blötdjur med svampdödande egenskaper och ger möjligheter till upptäckt av antivirulensmedel genom att utnyttja de naturliga hämmare som finns i blötdjur.
Introduction
Cryptococcus neoformans är en mänsklig svamppatogen som producerar allvarlig sjukdom hos immunsupprimerade värdar, såsom individer som lever med hiv / aids1, och leder till cirka 19% av AIDS-relaterade dödsfall2. Svampen är mottaglig för flera klasser av svampdödande medel, inklusive azoler, polyener och flucytosin, som utövar fungicid och fungistatisk aktivitet med hjälp av distinkta mekanismer 3,4. Den omfattande användningen av antimykotika i kliniska och jordbruksmiljöer i kombination med stamhybridisering har dock förstärkt utvecklingen av resistens hos flera svamparter, inklusive C. neoformans5.
För att övervinna utmaningarna med antimykotisk resistens och minska förekomsten av svampinfektioner på global nivå är ett lovande tillvägagångssätt att använda virulensfaktorerna för Cryptococcus spp. (t.ex. temperaturanpassningsförmåga, polysackaridkapsel, melanin och extracellulära enzymer) som potentiella terapeutiska mål 4,6 . Detta tillvägagångssätt har flera fördelar, eftersom dessa virulensfaktorer är väl karakteriserade i litteraturen, och inriktning på dessa faktorer kan potentiellt minska graden av svampdödande resistens genom att införa ett svagare selektivt tryck genom att försämra virulensen snarare än att rikta celltillväxt6. I detta sammanhang har många studier bedömt möjligheten att rikta extracellulära enzymer (t.ex. proteaser, peptidaser) för att minska eller hämma virulensen hos Cryptococcus spp.7,8,9.
Organismer som ryggradslösa djur och växter har inte ett adaptivt immunförsvar för att skydda sig mot patogener. De förlitar sig dock på ett starkt medfött immunförsvar med ett enormt utbud av kemiska föreningar för att hantera mikroorganismer och rovdjur10. Dessa molekyler innefattar peptidashämmare, som spelar viktiga roller i många biologiska system, inklusive cellulära processer av ryggradslösa immunitet, såsom koagulering av hemolymf, syntes av cytokiner och antimikrobiella peptider och skydd av värdar genom direkt inaktivering av proteaserna av patogener11. Således har peptidashämmare från ryggradslösa djur som blötdjur potentiella biomedicinska tillämpningar, men många förblir okarakteriserade10,12,13. I detta sammanhang finns det cirka 34 arter av landlevande blötdjur i Ontario och 180 sötvattenblötdjur i Kanada14. Men deras djupgående profilering och karakterisering är fortfarande begränsad15. Dessa organismer utgör en möjlighet att identifiera nya föreningar med potentiell anti-svampaktivitet10.
I detta protokoll beskrivs metoder för att isolera och klargöra extrakt från ryggradslösa djur (t.ex. blötdjur) (figur 1) följt av mätning av den förmodade peptidashämmande aktiviteten. De antimykotiska egenskaperna hos dessa extrakt bedöms sedan genom att mäta deras inverkan på produktionen av C. neoformans virulensfaktor med hjälp av fenotypiska analyser (figur 2). Det är viktigt att notera att skillnader i svampdödande egenskaper mellan råa och klarade extrakt kan tyda på mikrobiella faktorer (t.ex. sekundära metaboliter eller toxiner som produceras av värdmikrobiomet) hos blötdjuret, vilket kan påverka experimentella observationer. Sådana fynd stöder behovet av att detta protokoll bedömer både råa och klarade extrakt oberoende för att avslöja verkningssätten. Dessutom är extraktionsprocessen opartisk och kan möjliggöra detektion av antimikrobiella egenskaper mot en uppsjö av svamp- och bakteriepatogener. Därför ger detta protokoll en initieringspunkt för prioritering av blötdjursarter med svampdödande egenskaper mot C. neoformans och en möjlighet att utvärdera sambanden mellan enzymatisk aktivitet och virulensfaktorproduktion genom förmodade hämmande mekanismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Extraktionsprotokollet som beskrivs här beskriver isoleringen av föreningar från blötdjur som samlats in från Ontario, Kanada, och visar en ny undersökning av användning av blötdjursextrakt mot den mänskliga svamppatogenen, C. neoformans. Detta protokoll bidrar till en växande mängd forskning som undersöker peptidashämmare aktivitet från ryggradslösa djur13. Under extraktionen var vissa extraktprover svåra att filtersterilisera, möjligen på grund av närvaron av lösliga…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar medlemmarna i Geddes-McAlister Lab för deras värdefulla stöd under hela denna undersökning och deras manuskriptåterkoppling. Författarna erkänner finansieringsstödet från Ontario Graduate Scholarship and International Graduate Research Award – University of Guelph till DG-G och från Canadian Foundation of Innovation (JELF 38798) och Ontario Ministry of Colleges and Universities – Early Researcher Award för JG-M.
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
Referências
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S., Werger, M. J. A. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. , 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. . Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , (2013).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
