Évaluation des propriétés anticryptococciques présumées des extraits bruts et clarifiés de mollusques
Summary
L’agent pathogène fongique humain Cryptococcus neoformans produit une variété de facteurs de virulence (p. ex. peptidases) pour favoriser sa survie au sein de l’hôte. Les niches environnementales représentent une source prometteuse de nouveaux inhibiteurs naturels de la peptidase. Ce protocole décrit la préparation d’extraits de mollusques et l’évaluation de leur effet sur la production de facteurs de virulence fongiques.
Abstract
Cryptococcus neoformans est un pathogène fongique humain encapsulé avec une distribution mondiale qui infecte principalement les personnes immunodéprimées. L’utilisation généralisée des antifongiques en milieu clinique, leur utilisation en agriculture et l’hybridation des souches ont entraîné une évolution accrue de la résistance. Ce taux croissant de résistance aux antifongiques est une préoccupation croissante parmi les cliniciens et les scientifiques du monde entier, et il est de plus en plus urgent de développer de nouvelles thérapies antifongiques. Par exemple, C. neoformans produit plusieurs facteurs de virulence, y compris des enzymes intracellulaires et extracellulaires (par exemple, les peptidases) qui jouent un rôle dans la dégradation des tissus, la régulation cellulaire et l’acquisition des nutriments. La perturbation de cette activité peptidase par des inhibiteurs perturbe la croissance fongique et la prolifération, ce qui suggère que cela pourrait être une stratégie importante pour lutter contre l’agent pathogène. Il est important de noter que les invertébrés tels que les mollusques produisent des inhibiteurs de peptidases ayant des applications biomédicales et une activité antimicrobienne, mais ils sont sous-explorés en termes d’utilisation contre les pathogènes fongiques. Dans ce protocole, une extraction globale à partir de mollusques a été réalisée pour isoler les inhibiteurs potentiels de la peptidase dans des extraits bruts et clarifiés, et leurs effets contre les facteurs de virulence cryptococcique classiques ont été évalués. Cette méthode soutient la priorisation des mollusques ayant des propriétés antifongiques et offre des possibilités de découverte d’agents antivirulents en exploitant les inhibiteurs naturels présents dans les mollusques.
Introduction
Cryptococcus neoformans est un pathogène fongique humain qui produit une maladie grave chez les hôtes immunodéprimés, comme les personnes vivant avec le VIH/sida1, et entraîne environ 19 % des décès liés au sida2. Le champignon est sensible à plusieurs classes d’antifongiques, y compris les azoles, les polyènes et la flucytosine, qui exercent une activité fongicide et fongistatique en utilisant des mécanismes distincts 3,4. Cependant, l’utilisation intensive d’antifongiques dans des contextes cliniques et agricoles combinée à l’hybridation des souches a amplifié l’évolution de la résistance chez de multiples espèces fongiques, y compris C. neoformans5.
Pour surmonter les défis de la résistance antifongique et réduire la prévalence des infections fongiques à l’échelle mondiale, une approche prometteuse consiste à utiliser les facteurs de virulence de Cryptococcus spp. (p. ex. adaptabilité à la température, capsule polysaccharidique, mélanine et enzymes extracellulaires) comme cibles thérapeutiques potentielles 4,6 . Cette approche présente plusieurs avantages, car ces facteurs de virulence sont bien caractérisés dans la littérature, et le ciblage de ces facteurs pourrait potentiellement réduire les taux de résistance aux antifongiques en imposant une pression sélective plus faible en altérant la virulence plutôt qu’en ciblant la croissance cellulaire6. Dans ce contexte, de nombreuses études ont évalué la possibilité de cibler les enzymes extracellulaires (par exemple, les protéases, les peptidases) pour réduire ou inhiber la virulence de Cryptococcus spp.7,8,9.
Les organismes comme les invertébrés et les plantes ne possèdent pas de système immunitaire adaptatif pour se protéger des agents pathogènes. Cependant, ils s’appuient sur un système immunitaire inné fort avec une immense gamme de composés chimiques pour faire face aux micro-organismes et aux prédateurs10. Ces molécules comprennent les inhibiteurs de peptidase, qui jouent un rôle important dans de nombreux systèmes biologiques, y compris les processus cellulaires de l’immunité des invertébrés, tels que la coagulation de l’hémolymphe, la synthèse de cytokines et de peptides antimicrobiens, et la protection des hôtes en inactivant directement les protéases des agents pathogènes11. Ainsi, les inhibiteurs de peptidases d’invertébrés tels que les mollusques possèdent des applications biomédicales potentielles, mais beaucoup restent non caractérisés10,12,13. Dans ce contexte, il existe environ 34 espèces de mollusques terrestres en Ontario et 180 mollusques d’eau douce au Canada14. Cependant, leur profilage et leur caractérisation approfondis sont encore limités15. Ces organismes présentent une opportunité pour l’identification de nouveaux composés ayant une activité antifongique potentielle10.
Dans ce protocole, des méthodes pour isoler et clarifier des extraits d’invertébrés (par exemple, des mollusques) (Figure 1) suivies de la mesure de l’activité inhibitrice présumée de la peptidase sont décrites. Les propriétés antifongiques de ces extraits sont ensuite évaluées en mesurant leur impact sur la production de facteur de virulence de C. neoformans à l’aide de tests phénotypiques (Figure 2). Il est important de noter que les différences dans les propriétés antifongiques entre les extraits bruts et clarifiés peuvent indiquer des facteurs microbiens (p. ex. métabolites secondaires ou toxines produites par le microbiome hôte) du mollusque, qui peuvent influencer les observations expérimentales. De tels résultats soutiennent la nécessité pour ce protocole d’évaluer à la fois les extraits bruts et clarifiés indépendamment pour démêler les modes d’action. De plus, le processus d’extraction est impartial et peut permettre la détection de propriétés antimicrobiennes contre une pléthore d’agents pathogènes fongiques et bactériens. Par conséquent, ce protocole fournit un point d’initiation pour la priorisation des espèces de mollusques ayant des propriétés antifongiques contre C. neoformans et une occasion d’évaluer les liens entre l’activité enzymatique et la production de facteurs de virulence par des mécanismes inhibiteurs putatifs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole d’extraction décrit ici décrit l’isolement de composés de mollusques prélevés en Ontario, au Canada, et démontre une nouvelle étude sur l’utilisation d’extraits de mollusques contre l’agent pathogène fongique humain, C. neoformans. Ce protocole s’ajoute à un nombre croissant de recherches sur l’activité des inhibiteurs de la peptidase chez les invertébrés13. Au cours de l’extraction, certains échantillons d’extraits étaient difficiles à filtre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient les membres du laboratoire Geddes-McAlister pour leur précieux soutien tout au long de cette enquête et leurs commentaires sur les manuscrits. Les auteurs remercient D. G.-G et la Fondation canadienne de l’innovation (JELF 38798) et le Prix de nouveau chercheur du ministère des Collèges et Universités de l’Ontario pour J. G.-M.
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
Referências
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