Automatisierung des Mikronukleus-Assays mittels bildgebender Durchflusszytometrie und künstlicher Intelligenz
Summary
Der Mikronukleus-Assay (MN) ist ein etablierter Test zur Quantifizierung von DNA-Schäden. Die Bewertung des Assays mit herkömmlichen Techniken wie manueller Mikroskopie oder merkmalsbasierter Bildanalyse ist jedoch mühsam und herausfordernd. In diesem Artikel wird die Methodik zur Entwicklung eines Modells der künstlichen Intelligenz beschrieben, um den MN-Assay anhand von bildgebenden Durchflusszytometriedaten zu bewerten.
Abstract
Der Mikronukleus-Assay (MN) wird weltweit von Aufsichtsbehörden verwendet, um Chemikalien auf genetische Toxizität zu bewerten. Der Assay kann auf zwei Arten durchgeführt werden: durch Bewertung von MN in einmal geteilten, durch Zytokinese blockierten zweikernigen Zellen oder vollständig geteilten einkernigen Zellen. In der Vergangenheit war die Lichtmikroskopie die Goldstandardmethode, um den Assay zu bewerten, aber sie ist mühsam und subjektiv. Die Durchflusszytometrie wurde in den letzten Jahren zur Bewertung des Assays eingesetzt, ist jedoch durch die Unfähigkeit, wichtige Aspekte der zellulären Bildgebung visuell zu bestätigen, eingeschränkt. Die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) kombiniert Hochdurchsatz-Bilderfassung und automatisierte Bildanalyse und wurde erfolgreich eingesetzt, um schnell Bilder von allen Schlüsselereignissen im MN-Assay zu erfassen und zu bewerten. Kürzlich wurde gezeigt, dass Methoden der künstlichen Intelligenz (KI), die auf Convolutional Neural Networks basieren, zur Bewertung von MN-Assay-Daten verwendet werden können, die von IFC erfasst wurden. In diesem Whitepaper werden alle Schritte beschrieben, um mithilfe von KI-Software ein Deep-Learning-Modell zu erstellen, um alle wichtigen Ereignisse zu bewerten, und um dieses Modell anzuwenden, um zusätzliche Daten automatisch zu bewerten. Die Ergebnisse des KI-Deep-Learning-Modells lassen sich gut mit der manuellen Mikroskopie vergleichen und ermöglichen so eine vollautomatische Bewertung des MN-Assays durch die Kombination von IFC und KI.
Introduction
Der Mikronukleus-Assay (MN) ist in der genetischen Toxikologie von grundlegender Bedeutung, um DNA-Schäden bei der Entwicklung von Kosmetika, Pharmazeutika und Chemikalien für den menschlichen Gebrauch zu bewerten 1,2,3,4. Mikrokerne werden aus ganzen Chromosomen oder Chromosomenfragmenten gebildet, die sich nach der Teilung nicht in den Zellkern eingliedern und zu kleinen, kreisförmigen Körpern verdichten, die vom Zellkern getrennt sind. Somit kann MN als Endpunkt zur Quantifizierung von DNA-Schäden in Genotoxizitätstestsverwendet werden 1.
Die bevorzugte Methode zur Quantifizierung von MN ist in einmal geteilten zweikernigen Zellen (BNCs) durch Blockierung der Teilung mit Cytochalasin-B (Cyt-B). In dieser Version des Assays wird die Zytotoxizität auch durch das Scoring von einkernigen (MONO) und mehrkernigen (POLY) Zellen beurteilt. Der Assay kann auch durch Scoring von MN in nicht blockierten MONO-Zellen durchgeführt werden, was schneller und einfacher zu bewerten ist, wobei die Zytotoxizität anhand der Zellzählung vor und nach der Exposition bewertet wird, um die Proliferation zu beurteilen 5,6.
Die physikalische Bewertung des Assays wurde in der Vergangenheit durch manuelle Mikroskopie durchgeführt, da dies eine visuelle Bestätigung aller Schlüsselereignisse ermöglicht. Die manuelle Mikroskopie ist jedoch anspruchsvoll und subjektiv1. Daher wurden automatisierte Techniken entwickelt, darunter das Scannen von Objektträgern und die Durchflusszytometrie, die jeweils ihre eigenen Vor- und Nachteile haben. Während Objektträger-Scanning-Methoden die Visualisierung von Schlüsselereignissen ermöglichen, müssen Objektträger mit optimaler Zelldichte erstellt werden, was schwierig zu erreichen sein kann. Darüber hinaus fehlt dieser Technik oft die zytoplasmatische Visualisierung, was das Scoring von MONO- und POLY-Zellen beeinträchtigen kann 7,8. Während die Durchflusszytometrie eine Hochdurchsatz-Datenerfassung ermöglicht, müssen die Zellen lysiert werden, so dass die Verwendung der Cyt-B-Form des Assays nicht möglich ist. Darüber hinaus bietet die konventionelle Durchflusszytometrie als nicht-bildgebendes Verfahren keine visuelle Validierung von Schlüsselereignissen 9,10.
Daher wurde die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) untersucht, um den MN-Assay durchzuführen. Der ImageStreamX Mk II kombiniert die Geschwindigkeit und statistische Robustheit der konventionellen Durchflusszytometrie mit den hochauflösenden Bildgebungsmöglichkeiten der Mikroskopie in einem einzigen System11. Es hat sich gezeigt, dass durch den Einsatz von IFC hochauflösende Bilder aller Schlüsselereignisse erfasst und automatisch mit Hilfe von merkmalsbasierten12,13 oder Techniken der künstlichen Intelligenz (KI)14,15 bewertet werden können. Durch die Verwendung von IFC zur Durchführung des MN-Assays ist die automatische Bewertung von viel mehr Zellen im Vergleich zur Mikroskopie in kürzerer Zeit möglich.
Diese Arbeit weicht von einem zuvor beschriebenen Bildanalyse-Workflow16 ab und diskutiert alle Schritte, die erforderlich sind, um ein Random Forest (RF)- und/oder Convolutional Neural Network (CNN)-Modell unter Verwendung der Amnis AI-Software (im Folgenden als “KI-Software” bezeichnet) zu entwickeln und zu trainieren. Es werden alle notwendigen Schritte beschrieben, einschließlich der Befüllung von Ground-Truth-Daten mit KI-gestützten Tagging-Tools, der Interpretation der Ergebnisse des Modelltrainings und der Anwendung des Modells zur Klassifizierung zusätzlicher Daten, die die Berechnung der Genotoxizität und Zytotoxizität ermöglichen15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellte Arbeit beschreibt den Einsatz von Deep-Learning-Algorithmen zur Automatisierung des Scorings des MN-Assays. Mehrere neuere Veröffentlichungen haben gezeigt, dass intuitive, interaktive Werkzeuge die Erstellung von Deep-Learning-Modellen zur Analyse von Bilddaten ermöglichen, ohne dass tiefgreifende Rechenkenntnisse erforderlich sind18,19. Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll, das ein benutzeroberflächengesteuertes Softwarepaket ver…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nichts.
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC – ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software – IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software – INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer – 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
Referências
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