イメージングフローサイトメトリーと人工知能を用いた小核アッセイの自動化
Summary
小核(MN)アッセイは、DNA損傷を定量化するための確立されたテストです。ただし、手動顕微鏡や特徴ベースの画像分析などの従来の手法を使用してアッセイをスコアリングすることは、面倒で困難です。この論文では、イメージングフローサイトメトリーデータを使用してMNアッセイをスコアリングするための人工知能モデルを開発する方法論について説明します。
Abstract
小核(MN)アッセイは、化学物質の遺伝毒性を評価するために世界中の規制機関によって使用されています。アッセイは2つの方法で実施することができる:一度分裂した、細胞質分裂がブロックされた二核細胞または完全に分裂した単核細胞におけるMNをスコアリングすることによって。歴史的に、光学顕微鏡はアッセイをスコアリングするためのゴールドスタンダードの方法でしたが、それは面倒で主観的です。フローサイトメトリーは、近年、アッセイのスコアリングに使用されていますが、細胞画像の重要な側面を視覚的に確認できないため、制限されています。イメージングフローサイトメトリー(IFC)は、ハイスループット画像キャプチャと自動画像解析を組み合わせたもので、MNアッセイのすべての重要なイベントの画像を迅速に取得し、スコアリングするために成功裏に適用されています。最近、畳み込みニューラルネットワークに基づく人工知能(AI)手法を使用して、IFCが取得したMNアッセイデータをスコアリングできることが実証されました。このホワイトペーパーでは、AIソフトウェアを使用してディープラーニングモデルを作成し、すべての主要なイベントをスコアリングし、このモデルを適用して追加データを自動的にスコアリングするためのすべての手順について説明します。AIディープラーニングモデルの結果は、手動顕微鏡と比較して優れているため、IFCとAIを組み合わせることでMNアッセイの完全に自動化されたスコアリングが可能になります。
Introduction
小核(MN)アッセイは、ヒト用の化粧品、医薬品、および化学物質の開発におけるDNA損傷を評価するための遺伝毒物学の基本です1,2,3,4。小核は、分裂後に核に取り込まれず、核とは別の小さな円形体に凝縮する染色体全体または染色体断片から形成されます。したがって、MNは、遺伝毒性試験1におけるDNA損傷を定量するためのエンドポイントとして使用できます。
MNを定量するための好ましい方法は、サイトカラシン-B(Cyt-B)を用いて分裂をブロックすることによって一回分裂した二核細胞(BNC)内である。このバージョンのアッセイでは、細胞毒性は、単核(MONO)および多核(POLY)細胞のスコアリングによっても評価されます。このアッセイは、ブロックされていないMONO細胞におけるMNをスコアリングすることによっても実行することができ、これはより速く、より簡単にスコアリングすることができ、増殖を評価するために曝露前および曝露後の細胞カウントを使用して細胞毒性を評価する5,6。
アッセイの物理的スコアリングは、すべての重要なイベントを視覚的に確認できるため、歴史的に手動顕微鏡によって行われてきました。しかし、手動顕微鏡は困難で主観的です1。そのため、顕微鏡スライドスキャンやフローサイトメトリーなどの自動化技術が開発されていますが、それぞれに独自の利点と制限があります。スライドスキャン法では重要なイベントを視覚化できますが、スライドは最適なセル密度で作成する必要があり、達成が困難な場合があります。さらに、この手法は細胞質の可視化を欠いていることが多く、MONO細胞とPOLY細胞のスコアリングを損なう可能性があります7,8。フローサイトメトリーはハイスループットなデータキャプチャを提供しますが、細胞を溶解する必要があるため、Cyt-B型のアッセイを使用することはできません。さらに、非イメージング技術として、従来のフローサイトメトリーは重要な事象の視覚的検証を提供しない9、10。
そのため、MNアッセイを行うためにイメージングフローサイトメトリー(IFC)が検討されている。ImageStreamX Mk IIは、従来のフローサイトメトリーの速度と統計的堅牢性を、顕微鏡の高解像度イメージング機能を単一のシステムで組み合わせた11。IFCを使用することにより、すべての主要なイベントの高解像度画像をキャプチャし、特徴ベースの12,13または人工知能(AI)技術14,15を使用して自動的にスコアリングできることが示されています。IFCを使用してMNアッセイを行うことにより、顕微鏡検査と比較して、より短時間でより多くの細胞を自動的にスコアリングすることができます。
この作業は、前述の画像分析ワークフロー16 から逸脱し、Amnis AIソフトウェア(以下「AIソフトウェア」と呼ぶ)を使用してランダムフォレスト(RF)および/または畳み込みニューラルネットワーク(CNN)モデルを開発およびトレーニングするために必要なすべてのステップについて説明します。AI支援タグ付けツールを使用したグラウンドトゥルースデータの入力、モデルトレーニング結果の解釈、追加データを分類するためのモデルの適用など、必要なすべてのステップが説明されており、遺伝毒性と細胞毒性の計算が可能になります15。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介する研究では、MNアッセイのスコアリングを自動化するためのディープラーニングアルゴリズムの使用について説明しています。最近のいくつかの出版物は、直感的でインタラクティブなツールが、深い計算知識を必要とせずに画像データを分析するための深層学習モデルの作成を可能にすることを示しています18,19。ユーザーインター?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
何一つ。
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC – ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software – IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software – INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer – 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
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