BEMÆRK: Brug sterilt kulturglas, pipettespidser og vækstmedium. Her blev E. coli-celler dyrket i et kemisk defineret medium med lav autofluorescens (se materialetabel). Inokulationer blev udført i nærværelse af en bunsenbrænder for at minimere risikoen for forurening. 1. Cellekultur og vækstkurve Stribe interessestammen fra en frossen glycerolbestand på en Luria-Bertaini (LB) agarplade (suppleret med et selektivt antibiotikum, hvis det kræves), og inkuber ved 37 ° C natten over (mellem 15 timer og 19 timer) for at opnå enkeltkolonier.BEMÆRK: Eksperimentet, der præsenteres her, bruger to stammer, E. coli K-12 MG1655 svarende til wt-stammen og den isogene MG1655 hupA-mCherry-stamme 22. Sidstnævnte stamme udtrykker den fluorescensmærkede α-underenhed af det HU-nukleoidassocierede protein. hupA-mCherry-reporteren er integreret på hupA’s oprindelige sted. HU-mCherry fungerer som en proxy til at følge nukleoiddynamikken i levende celler, da den binder til DNA på en ikke-specifik måde. Der podes 5 ml medium (her 3-[N-morpholino] propansulfonsyrebaseret medium [MOPS]; Tabel 1, tabel 2 og tabel 3) suppleret med glucose 0,4% og et selektivt antibiotikum (hvis nødvendigt) med en isoleret koloni i et glasrør (≥25 ml), og anbring røret i en rysteinkubator indstillet til 37 °C og 180 rotationer pr. minut (o / min) natten over (mellem 15 timer og 19 timer). Alternativt kan plastrør, glas eller plastkolber (≥ 25 ml) bruges i stedet for glasrør.BEMÆRK: MOPS-medium suppleret med glycerol i en slutkoncentration på 0,4% blev anvendt i hele eksperimenterne beskrevet i denne artikel, bortset fra de natkulturer, der blev udført i MOPS-glucose 0,4%. Generationstiden for E. coli i MOPS suppleret med glukose er kortere end i MOPS glycerol. Brug af MOPS-glukose 0,4% i stedet for MOPS-glycerol 0,4% på dette trin sikrer, at cellerne når den stationære fase inden for 19 timer. Andre vækstmedier, såsom M9 eller rige definerede medium (RDM) suppleret med forskellige kulstofkilder, kan også anvendes. Det skal dog bemærkes, at væksthastigheden og persistensfrekvensen er forskellig afhængigt af det anvendte medium og/eller kulstof23. Den følgende morgen centrifugeres 1 ml kultur ved 2.300 x g i 3 minutter, supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes forsigtigt i samme mængde fosfatbufferet saltvand (PBS). Mål den optiske densitet ved 600 nm (OD 600 nm), og beregn det nødvendige volumen for en indledende OD600 nm på 0,01 i et slutvolumen på 2 ml. Anbring 2 ml MOPS-glycerol 0,4% medium i en brønd med en klar bundplade med 24 brønde, og pod med det beregnede kulturvolumen natten over. Pladen med 24 brønde anbringes i en automatisk mikropladelæser (se materialetabellen) for at overvåge OD600 nm i 24 timer. Indstil mikropladelæseren til at måle OD600 nm hvert 15. minut ved en temperatur på 37 °C og med høj orbitalrotation (140 omdr./min.).BEMÆRK: Hvis den stamme, der anvendes i eksperimentet, koder for en fluorescerende reporter, skal du sørge for, at dens væksthastighed er sammenlignelig med wt for at undgå artefakt i de efterfølgende eksperimenter, da væksthastigheden påvirker antibiotikapersistensfrekvensen23. På grund af detektionsbegrænsninger ved meget lave celletætheder og de potentielle stammespecifikke virkninger på OD600 nm/kolonidannende enheder (CFU) anbefales det at evaluere vækstkinetikken ved at overvåge CFU·mL-1 , når der arbejdes med ukarakteriserede stammer. 2. Bestemmelse af den minimale hæmmende koncentration af antibiotika BEMÆRK: Den mindste hæmmende koncentration (MIC) defineres som den laveste dosis antibiotika, hvor der ikke observeres bakterievækst. Bestemmelsen af MIC skal udføres for hvert antibiotikum og stamme. I de her beskrevne eksperimenter blev fluorquinolonantibiotikumet ofloxacin (OFX) anvendt. Bestemmelsen af MIC gør det muligt at bekræfte, at antibiotikaopløsningen er korrekt fremstillet, antibiotika er aktivt, og stammerne er lige så følsomme over for antibiotika. Her blev den offentliggjorte agarfortyndingsmetode udført for at bestemme MIC til OFX af de forskellige anvendte stammer24. MIC for et givet antibiotikum til en given bakteriestamme kan også bestemmes via bouillonfortyndingsmetode24. Klargøring af pladerne til bestemmelse af den nationale mikrofonForbered en stamopløsning til det antibiotikum, der anvendes i forsøgene, ved at opløse 5 mg OFX i 1 ml ultrarent vand. Tilsæt 20 μL 37% HCI for at øge opløseligheden af OFX. Smelt 100 ml steril LB-agar, og opbevar den ved 55 °C for at undgå størkning. Der fremstilles seks små glaskolber (25 ml), og der pipetteres 5 ml flydende LB-agarmedium i hver kolbe med en steril pipette. 10 μL af 5 mg·ml-1 OFX-stamopløsningen fortyndes i 90 μL ultrarent vand (1:10 fortynding af stamstammen). Der tilsættes 0 μL, 2 μL, 4 μL, 6 μL, 8 μL eller 10 μL af 500 μg·mL-1 OFX-opløsningen til hver af de seks glaskolber, der indeholder 5 ml LB agarsubstrat, for at generere LB-agarmedium med endelige koncentrationer på 0 μg·ml−1, 0,02 μg·ml−1, 0,04 μg·ml−1, 0,06 μg·ml−1, 0,08 μg·ml−1 og 0,1 μg·ml-1 OFX. Bland opløsningen ved at dreje kolberne flere gange.BEMÆRK: Hvis MIC for det pågældende antibiotikum er kendt, bør koncentrationsområdet nå fra neden til over den faktiske MIC. Hvis mikrofonen er ukendt, anbefales et stort koncentrationsinterval med en log 2-fortyndingsserie. Sørg for, at LB-agarmediet er afkølet, før du tilsætter antibiotika, da høje temperaturer kan inaktivere det. Ikke desto mindre er det vigtigt ikke at lade LB-agarmediet størkne, før antibiotika tilsættes, da dette kan føre til en ikke-homogen fordeling af antibiotika i LB-agarmediet. 5 ml af hvert af de seks LB agarsubstrater, der er fremstillet i trin 2.1.3, hældes dosisforøgende i en 6-hullers dyrkningsplade med en steril pipette. Lad agaren køle af, indtil den størkner, og tør pladen inden brug.BEMÆRK: Forbered antibiotikaopløsningen og kulturpladen den dag, analysen udføres. MIC-bestemmelsesanalyseDer podes 5 ml LB-substrat med en isoleret koloni i et glasrør (≥25 ml), og glasrøret anbringes i en rysteinkubator indstillet til 37 °C og 180 o/min natten over (mellem 15 timer og 19 timer). Den følgende morgen måles OD600 nm, og kulturen fortyndes til et reagensglas til en endelig celletæthed på 1 x 107 CFU·ml-1 i PBS. For de stammer, der testes her, svarer 1 x 107 CFU·mL−1 til en OD600 nm på 0,0125.BEMÆRK: Hvis korrelationen mellem CFU·mL-1 og OD 600 nm ikke er kendt, skal vækstkurven bestemt ved CFU- og OD 600 nm-målinger etableres for at beregne korrelationsfaktoren mellem CFU·ml-1 og OD 600 nm. Spot 2 μL af den tidligere fortyndede kultur på hvert hul i den tørrede 6-brønds plade. Lad pletterne tørre, inden pladen anbringes i en inkubator ved 37 °C natten over (mellem 15 timer og 19 timer). Den næste dag tæller kolonierne dannet i hver brønd. MIC svarer til brønden med den mindste koncentration af antibiotika, hvor der ikke påvises bakterievækst. 3. Spot-analyse BEMÆRK: Spotanalysemetoden er en kvalitativ tilgang, der gør det muligt at estimere antallet af levedygtige celler (celler, der er i stand til at generere kolonier efter antibiotikastress). Spotanalysen udføres før time-kill-analysen for at give indsigt i levedygtigheden af den stamme, der anvendes under de testede betingelser, og for at informere om de fortyndinger, der er nødvendige under time-kill-analysen (se afsnit 4). For at forberede LB-agarpladerne til spotanalyser hældes 50 ml LB-agar i et firkantet petrifad (144 cm2). Forbered en firkantet petriskål pr. Tidspunkt. Lad LB-agaren størkne, og tør pladerne inden brug. Der podes 5 ml medium (MOPS-glucose 0,4%) med en isoleret koloni i et glasrør (≥25 ml), og røret anbringes i en rysteinkubator indstillet til 37 °C og 180 omdr./min. natten over (mellem 15 timer og 19 timer). Den næste dag måles OD 600 nm, og kulturen fortyndes til frisk temperaturjusteret medium (37 ° C, MOPS glycerol 0,4%) i et glasrør (≥25 ml) til en endelig OD600 nm på ~0,001 . Lad kulturen vokse natten over i en inkubator ved 37 °C ved 180 o / min (mellem 15 timer og 19 timer). Den følgende dag måles OD 600 nm, og kulturen inkuberes til en endelig OD600 nm på 0,3. Under inkubationen fremstilles plader med 96 brønde ved at anbringe 90 μL 0,01 MMgSO4-opløsning i alle brønde undtagen hullerne i første række (række A). 96-brøndspladerne vil blive brugt til 10 gange seriel fortynding i trin 3.7.BEMÆRK: I dette eksperiment blev to stammer (wt og hupA-mCherry-stamme ) testet i tre eksemplarer på syv forskellige tidspunkter. Da en plade består af 12 søjler, kan en plade bruges til to tidspunkter, og således blev der forberedt i alt fire plader. Ved en OD 600 nm på 0,3 udtages200 μL af hver bakteriekultur. Disse prøver svarer til t0 (ubehandlet) tidspunkt før antibiotikabehandlingen og tillader bestemmelse af CFU·ml-1 før antibiotikabehandling. Prøverne centrifugeres ved 2.300 x g i 3 min. Under centrifugeringstiden tilsættes den ønskede koncentration af OFX til den flydende kultur, og inkubationen fortsætter ved 37 °C under omrystning.BEMÆRK: Her blev OFX anvendt i en koncentration på 5 μg·ml-1 (svarende til MIC ganget 83 gange). I en tidligere undersøgelse blev denne koncentration anvendt til at karakterisere persistensfænomenet under OFX-eksponering25. Den antibiotikakoncentration, der anvendes til tids-/drabsanalyserne, kan variere afhængigt af antibiotika, kulturmediet og tilstanden af bakterievækst. Efter centrifugering resuspenderes cellepelleten i 200 μL 0,01 MMgSO4-opløsning . 100 μL anbringes i det tomme hul på 96-brøndspladen, der er forberedt i trin 3.5. Der udføres en fortynding ved at overføre 10 μL af hullet i række A til brønden i række B indeholdende 90 μL 0,01 MMgSO4. De serielle fortyndinger fortsættes ved at overføre 10 μL af hullet i række B til brønden i række C. Gentag det, indtil der opnås en fortynding på 10-7 (hvor hver overførsel er en 10 gange fortynding).BEMÆRK: I dette eksperiment blev seks kulturer (tre for wt-stammen og tre for hupA-mCherry-stammen ) testet for hvert tidspunkt. Ifølge protokollen anvendes en muti-kanalpipette til at udføre de serielle fortyndinger for de seks stammer på samme tid. For at minimere den tekniske fejl ændres pipettespidserne mellem hver overførsel. Der anbringes 10 μL af hver fortynding på LB-agarpladerne fremstillet i trin 3.1.BEMÆRK: En flerkanalpipette bruges til samtidig at spotte den samme fortynding (f.eks. en 10-4 fortynding) for de seks kulturer. Under spottingen skal det første stop på multikanalpipetten bruges uden at skubbe det andet stop, da dette kan resultere i, at mikrodråber dispenseres på pladen. På relevante tidspunkter efter tilsætning af antibiotika udtages 200 μL af kulturen, og der udføres serielle fortyndinger som beskrevet i trin 3.8. Spot 10 μL af hver fortynding som beskrevet i trin 3.9.BEMÆRK: Til eksperimentet beskrevet her blev syv tidspunkter indsamlet (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). For stammer, der udviser øget antibiotikafølsomhed sammenlignet med vægt, kan der udføres flere vaske i MgSO4 0,01 M for at fjerne resterende antibiotika. Pladerne inkuberes ved 37 °C natten over (mellem 15 timer og 19 timer). Den næste dag tælles antallet af kolonier ved de to højeste fortyndinger, for hvilke kolonier kan detekteres. Ideelt set indeholder pletterne på agarpladerne for disse fortyndinger mellem 3 og 30 kolonier, hvilket muliggør nøjagtig bestemmelse af CFU·ml-1 for hver prøve. Beregn overlevelsesraten ved at dividere den beregnede CFU·mL-1 for hvert tidspunkt med CFU·mL-1 for den oprindelige population ved t0. 4. Tidsdræbende assays BEMÆRK: Mens spotanalyser er en brugervenlig metode til at estimere overlevelsesraten for en given stamme for et givet antibiotikum, giver tidsdræbende assays en overlevelsesrate med højere opløsning og udføres for nøjagtigt at kvantificere bakteriens levedygtighed. Profilen af drabskurven kan bruges til at bestemme, om en given bakteriestamme er følsom, tolerant eller resistent over for antibiotika i en given tilstand. Desuden tillader time-kill-assays bestemmelse af den tid for antibiotikaeksponering, der er nødvendig for at detektere persistensfænomenet (begyndelsen af den anden hældning af den bifasiske drabskurve) såvel som persistensfrekvensen. Forbered LB-agarplader til time-kill plating-analysen. Hæld 25 ml LB agar i en petriskål (±57 cm2). Tilbered mindst to petriskåle pr. tidspunkt (to fortyndinger pr. time pr. stamme er belagt). Lad LB-agaren størkne, og tør pladerne, inden du tilføjer fem til otte sterile glasperler til hver plade. Vend og mærk pladerne i henhold til stammen/tilstanden/tidspunktet.BEMÆRK: Glasperler tillader spredning af bakterier på agarpladerne under trin 4.7 og trin 4.9. Alternativt kan cellerne dispergeres på agarpladen ved hjælp af en spreder. For hver prøve fremstilles 10 gange serielle fortyndingsglasrør indeholdende 900 μL 0,01 MMgSO4-opløsning . Antallet af fortyndingsglasrør pr. prøve, der skal forberedes, svarer til de fortyndinger, der er nødvendige for at påvise kolonier i spotassayet. Der podes 5 ml medium (MOPS-glucose 0,4%) med en isoleret koloni i et glasrør (≥25 ml), og røret anbringes i en rysteinkubator indstillet til 37 °C og 180 omdr./min. natten over (mellem 15 timer og 19 timer). Efter 16 timers vækst måles OD 600 nm, og kulturen fortyndes til frisk temperaturjusteret medium (37 °C, MOPS-glycerol 0,4%) i et glasrør til en endelig OD600 nm på ~0,001 . Lad kulturen vokse natten over i en inkubator ved 37 °C ved 180 o / min (mellem 15 timer og 19 timer). Den følgende dag måles OD 600 nm, og kulturen inkuberes til en endelig OD600 nm på 0,3. Ved en OD 600 nm på 0,3 udtages 100 μL af kulturen, fortyndes i henhold til de data, der er opnået i spotanalysen (ved en OD600 nm på 0,3 og uden antibiotikum giver en 10-5 fortynding normalt 200-300 kolonier) og plade100 μL på LB-agarpladerne fremstillet i trin 4.1-4.2. Ryst forsigtigt pladerne for at undgå, at perlerne kommer i kontakt med skålens kanter, da dette kan føre til en ikke-homogen spredning af bakteriecellerne på LB-agarmediet. Denne første prøve før antibiotikabehandlingen svarer til t0-tidspunktet (CFU·ml-1 før antibiotikabehandling). Den ønskede koncentration af OFX tilsættes og inkuberes fortsat ved 37 °C under omrystning.BEMÆRK: Her blev OFX anvendt i en koncentration på 5 μg·ml-1 (svarende til MIC ganget 83 gange). På relevante tidspunkter efter tilsætning af antibiotika udtages 100 μL af kulturen, fortyndes i overensstemmelse med de data, der er opnået i spotanalysen, og plade 100 μL på LB-agarpladerne fremstillet i trin 4.1-4.2. Pladerne på cellerne som beskrevet i trin 4.7.BEMÆRK: Til eksperimentet beskrevet her blev syv tidspunkter indsamlet (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). For stammer, der udviser en øget antibiotikafølsomhed sammenlignet med vægten, kan der udføres flere vaske i MgSO4 0,01 M for at fjerne resterende antibiotika. Pladerne inkuberes ved 37 °C natten over (mellem 15 timer og 19 timer). Den næste dag tælles antallet af kolonier ved de to højeste fortyndinger, for hvilke kolonier kan detekteres. Ideelt set bør pladerne indeholde 30-300 kolonier for at muliggøre en nøjagtig bestemmelse af CFU·mL-1 i hver prøve. Beregn overlevelsesforholdet ved at normalisere CFU·mL-1 på hvert tidspunkt med CFU·mL-1 ved t0. Plot log10 normaliseret CFU·mL-1 som funktion af tiden. 5. Mikrofluidisk time-lapse mikroskopi billeddannelse BEMÆRK: Følgende afsnit beskriver forberedelsen af den mikrofluidiske plade samt time-lapse-billedoptagelses- og billedanalyseproceduren. Formålet med dette eksperiment er at observere og analysere persistensfænotypen ved antibiotikabehandling på enkeltcelleniveau. De data, der indsamles under dette eksperiment, kan bruges til at generere en lang række resultater afhængigt af det behandlede spørgsmål og / eller de fluorescerende reportere, der blev brugt under eksperimentet. I eksperimentet beskrevet her blev kvantitativ analyse af cellelængden og HU-mCherry-fluorescens22, der afspejler nukleoidorganisationen i persisterende og ikke-persisterende celler, udført. Bakteriel cellekultur til mikrofluidisk time-lapse mikroskopiDer podes 5 ml medium (MOPS-glycerol 0,4 %, om nødvendigt suppleret med et selektivt antibiotikum) med en isoleret koloni i et glasrør (≥25 ml), og røret anbringes i en rysteinkubator indstillet til 37 °C og 180 omdr./min. natten over (mellem 15 timer og 19 timer). Den næste dag måles OD 600 nm, og kulturen fortyndes i frisk temperaturjusteret medium (37 ° C, MOPS glycerol 0,4%) i et glasrør til en endelig OD600 nm på ~0,001 . Lad kulturen vokse natten over (mellem 15 timer og 19 timer) i en rystekuvøse ved 37 °C og 180 o / min for at opnå en tidlig eksponentiel fasekultur den næste dag. Fremstilling af mikrofluidisk plade og time-lapse mikroskopi billeddannelseBEMÆRK: Mikrofluidiske eksperimenter kan udføres i kommercielt tilgængelige mikrofluidiske enheder (som beskrevet her) eller i internt producerede mikrofluidiske systemer.Fjern konserveringsopløsningen (hvis den er til stede) fra hvert hul i den mikrofluidiske plade, og erstat den med et frisk dyrkningsmedium.BEMÆRK: Hvis den mikrofluidiske plade indeholder en affaldsudløbsbrønd, skal opløsningsopløsningen af udløbsbrønden fjernes, men ikke erstattes af mediet. Forsegl den mikrofluidiske plade med manifoldsystemet ved at klikke på knappen Seal eller gennem den mikrofluidiske software (vælg først Tool, efterfulgt af Seal Plate).BEMÆRK: For at forsegle pladen skal der påføres et ensartet tryk på pladen og manifolden ved manuelt at klemme pladen mod manifolden. Hvis det udføres korrekt, skal noten “forseglet” vises på ONIX2-grænsefladen. Det er vigtigt ikke at lægge pres på glasglasset for at undgå enhver potentiel risiko for at bryde manifolden. Når den er forseglet, skal du udføre en første primingsekvens (klik på Kør flydende primingsekvens på den mikrofluidiske softwaregrænseflade).BEMÆRK: Kør flydende primingsekvens svarer til 5 minutters perfusion ved 6,9 kPa for brønd 1-5, efterfulgt af 5 minutters perfusion ved 6,9 kPa for brønd 8 og en sidste perfusionsrunde for brønd 6 for 5 minutter ved 6,9 kPa. Run Liquid Priming Sequence gør det muligt at fjerne den konserveringsopløsning, der stadig kan være til stede i kanalerne, der forbinder de forskellige brønde. Pladen inkuberes i et termostatstyret mikroskopkabinet ved den ønskede temperatur (her 37 °C) i mindst 2 timer, før mikroskopibilleddannelsen påbegyndes. Start en anden Run Liquid Priming Sequence , før eksperimentet påbegyndes. Forsegl den mikrofluidiske plade ved at klikke på Seal off på den mikrofluidiske softwaregrænseflade. Substratet erstattes i hul 1 og hul 2 med 200 μL frisk substrat, i hul 3 med 200 μL frisk substrat indeholdende antibiotikummet (her OFX ved 5 μg·ml-1), i hul 4 og hul 5 med 200 μL frisk substrat, i hul 6 med 200 μL frisk substrat og i hul 8 med 200 μL af kulturprøven (fra trin 5.1.2) fortyndet til en OD600 nm på 0,01 i frisk substrat. Den mikrofluidiske plade forsegles som beskrevet i trin 5.2.2, og pladen anbringes på mikroskopmålet inde i mikroskopkabinettet.BEMÆRK: Sørg for at placere en dråbe nedsænkningsolie på mikroskopmålet, før du placerer den mikrofluidiske plade. I den mikrofluidiske software skal du klikke på Celleindlæsning for at tillade, at cellen indlæses i den mikrofluidiske plade.BEMÆRK: Celleindlæsningstrinnet består af 15 s perfusion ved 13,8 kPa for brønd 8, efterfulgt af 15 s perfusion ved 27,6 kPa for brønd 6 og brønd 8 og en sidste perfusionsrunde for brønd 6 for 30 s ved 6,9 kPa. Tætheden af cellerne i den mikrofluidiske plade er kritisk for eksperimentet. Den første del af denne mikrofluidiske protokol består af voksende bakterier i 6 timer i et frisk medium før antibiotikabehandlingen. Efter 6 timers vækst skal celletætheden være tilstrækkelig til at detektere de sjældne persisterende celler (under de betingelser, der anvendes i denne undersøgelse, genererer de persisterende celler med en frekvens på 10-4). Hvis celletætheden er for høj, er det svært at skelne mellem de enkelte celler, hvilket forhindrer præcis enkeltcelleanalyse. Da væksthastigheden er direkte afhængig af mediet, bør tætheden af celler i mikroskopifelterne vurderes, inden forsøget påbegyndes. Indstil et optimalt fokus ved hjælp af transmitteret lystilstand, og vælg flere interesseområder (ROI’er), hvor der observeres et passende cellenummer (op til 300 celler pr. Felt).BEMÆRK: Vælg mindst 40 ROI’er for at sikre, at de sjældne persisterceller er afbildet. På den mikrofluidiske software skal du klikke på Opret en protokol. Frisk substrat programmeres ved 6,9 kPa i 6 timer (hul 1-2), efterfulgt af injektion af mediet indeholdende antibiotika ved 6,9 kPa i 6 timer (hul 3) og endelig injektion af frisk substrat ved 6,9 kPa i 20 timer (hul 4-5).BEMÆRK: En bakteriekultur fortyndet til en OD600 nm på 0,01 tillader bakterier at vokse i det mikrofluidiske kammer i 6 timer, hvilket sikrer, at cellerne er i den eksponentielle vækstfase. Afhængigt af antallet af celler, der indføres i den mikrofluidiske anordning under indlæsningstrinnet (se trin 5.2.8), kan varigheden af vækstfasen tilpasses til at opnå op til 300 celler pr. ROI. Da persistens er et sjældent fænomen, forbedrer øget antal celler pr. ROI muligheden for at observere persisterende celler. Cellenummeret bør dog ikke overstige 300 celler pr. ROI, da dette gør enkeltcelleanalyse kedelig. Udfør mikroskopibilleddannelse i timelapse-tilstand med et billede hvert 15. minut ved hjælp af transmitteret lys og excitationslyskilden til den fluorescerende reporter. Her blev der brugt en 560 nm excitationslyskilde til mCherry-signalet (580 nm LED ved 10% effekt med filter 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] og 100 ms eksponering for mCherry). Den Zeiss-kompatible Zen3.2-software blev brugt til cellebilleddannelse. BilledanalyseBEMÆRK: Åbningen og visualiseringen af mikroskopibillederne udføres med open source ImageJ/Fiji-softwaren (https://fiji.sc/)26. Den kvantitative billedanalyse udføres ved hjælp af open source ImageJ/Fiji-softwaren og det gratis MicrobeJ-plugin (https://microbej.com)27. I denne protokol blev MicrobeJ 5.13I(14)-versionen anvendt.Åbn ImageJ/Fiji-softwaren på computeren, og træk hyperstack time-lapse-mikroskopibillederne til Fiji-indlæsningsbjælken. Brug Image > Color > Make Composite til at smelte de forskellige kanaler i hyperstacken. Hvis kanalerne i timelapse-eksperimentet ikke svarer til den ønskede farve (f.eks. vises fasekontrasten med rødt i stedet for gråt), skal du bruge Image > Color > Arranger kanaler til at anvende den relevante farve på kanalerne. Åbn MicrobeJ-pluginet, og registrer bakteriecellerne ved hjælp af den manuelle redigeringsgrænseflade. Slet de automatisk registrerede celler, og opret manuelt en disposition for de vedvarende celler af interesse billede for billede.BEMÆRK: Forskellige indstillinger kan bruges til automatisk at registrere individuelle celler. Manuel detektion blev brugt her, da de analyserede persisterceller danner lange filamenter, som sjældent detekteres korrekt ved hjælp af automatisk detektion. Efter registrering skal du bruge ikonet Resultat i MicrobeJ’s manuelle redigeringsgrænseflade til at generere en ResultJ-tabel. Gem filen ResultJ, og brug tabellen ResultJ til at få indsigt i forskellige parametre af interesse for enkeltcelleanalysen. I tilfælde af denne protokol blev den gennemsnitlige fluorescens af HU-mCherry-intensiteten, cellelængden og cellearealet af individuelle celler eksporteret.