Populations- och encellsanalys av antibiotikapersistens i Escherichia coli

Summary

Antibiotisk persistens beskriver förmågan hos små subpopulationer inom en känslig isogen population att tillfälligt tolerera höga doser bakteriedödande antibiotika. Detta protokoll kombinerar metoder för att karakterisera fenotypen för antibiotikapersistens på molekylär och cellulär nivå efter exponering av Escherichia coli för dödliga doser av ofloxacin.

Abstract

Antibiotisk persistens avser förmågan hos små bakteriella subpopulationer att tillfälligt tolerera höga doser bakteriedödande antibiotika. Vid bakteriedödande antibiotikabehandling dödas huvuddelen av bakteriepopulationen snabbt. Denna första snabba fas av avlivning följs av en betydande minskning av avlivningshastigheten eftersom de persisterande cellerna förblir livskraftiga. Klassiskt bestäms persistensen på populationsnivå genom tids-/avdödningsanalyser som utförs med höga doser antibiotika och för definierade exponeringstider. Även om denna metod ger information om nivån av persisterande celler och dödskinetiken, återspeglar den inte den inneboende cell-till-cell-heterogeniteten som ligger bakom persistensfenomenet. Protokollet som beskrivs här kombinerar klassiska time/kill-analyser med encellsanalys med hjälp av fluorescensmikroskopi i realtid. Genom att använda lämpliga fluorescerande reportrar kan mikroskopiavbildning av levande celler ge information om antibiotikumets effekter på cellulära processer, såsom kromosomreplikation och segregering, cellförlängning och celldelning. Kombinationen av populations- och encellsanalys möjliggör molekylär och cellulär karakterisering av persistensfenotypen.

Introduction

Detta protokoll syftar till att analysera den bakteriella persistensfenotypen som svar på specifik antibiotikabehandling på encells- och befolkningsnivå. Persistens beskriver kapaciteten hos små subpopulationer inom en isogen population att uthärda höga doser av bakteriedödande antibiotika (fluorokinoloner, aminoglykosider, β-laktamer, etc.), med den minimala hämmande koncentrationen (MIC) av de så kallade persistercellerna som är identisk med den för huvuddelen av befolkningen. Bifasisk dödande dynamik, vid mätning av bakteriell överlevnad över tid i närvaro av ett antibiotikum, avslöjar närvaron av tillfälligt läkemedelstoleranta celler, med en initial snabb utrotning av de icke-persisterande cellerna, följt av en mycket långsammare dödande hastighet av persistercellerna. Vid antibiotikaavlägsnande ger dessa celler upphov till en genetiskt identisk population som uppvisar liknande dödande dynamik när de behandlas med samma antibiotikum ^1,2. I motsats till persistens definieras antibiotikaresistens på populationsnivå och är i allmänhet en följd av antingen de novo-mutationer eller horisontell genöverföring av en resistensgivande plasmid³. Medan mutationerna som är ansvariga för resistens mestadels finns i läkemedlets mål eller i de promotoriska regionerna i läkemedelseffluxpumparna, har gener som förändrar persistensfrekvensen som identifierats av genomomfattande och riktade mutantanalysmetoder visat sig vara många och olika 2,3,4,5,6,7,8 . Därför är det troligt att bakterieceller kan komma in i persistertillståndet genom flera vägar 9,10,11^, och metoder för att undersöka persistensfenomenet på encellsnivå behövs för att karakterisera fysiologin hos dessa persisterceller.

Den senaste utvecklingen av mikrofluidiska verktyg som används i kombination med fluorescensmikroskopi har banat väg för karakterisering av persistensfenotypen och belyst rollen för viktiga cellulära processer, såsom kromosomreplikation¹², DNA-reparation 13 och celldelning¹⁴, i persistercellbildning. I denna artikel beskriver vi ett integrerat tillvägagångssätt som kombinerar klassiska mikrobiologiska analyser med encells levande avbildning för att karakterisera persisterceller genererade i exponentiellt växande Escherichia coli-kulturer behandlade med en hög dos ofloxacin. Protokollet som beskrivs här kan tillämpas för att studera antibiotikapersistensfenomenet hos andra bakteriearter, såsom Bacillus^{subtilis 15}, eller tillstånd (t.ex. antibiotikapersistens efter β-laktambehandling 16) och kan enkelt modifieras för att undersöka de många fenomen som involverar fenotypisk heterogenitet^17,18,19 . Dessutom kan uppställningen som beskrivs i denna artikel kombineras med andra fluorescerande reportrar för att undersöka distinkta cellulära parametrar av intresse, såsom intracellulära nivåer av pH²⁰ eller ATP²¹ på encellsnivå, vilket potentiellt kan ge nya insikter om antibiotikapersistensfenomenet.

Protocol

OBS: Använd sterilt kulturglas, pipettspetsar och tillväxtmedium. Här odlades E. coli-celler i ett kemiskt definierat medium med låg autofluorescens (se materialtabell). Inokuleringar utfördes i närvaro av en Bunsen-brännare för att minimera risken för kontaminering. 1. Cellodling och tillväxtkurva Stryk den intressanta stammen från en fryst glycerolstam på en Luria-Bertaini (LB) agarplatta (kompletterad med ett selektivt antibiotikum, om så krävs) och inkubera vid 37 °C över natten (mellan 15 och 19 timmar) för att erhålla enstaka kolonier.OBS: Experimentet som presenteras här använder två stammar, E. coli K-12 MG1655 motsvarande wt-stammen och den isogena MG1655 hupA-mCherry-stammen 22. Den senare stammen uttrycker den fluorescensmärkta α-underenheten i HU-nukleoidassocierat protein. hupA-mCherry-reportern är integrerad på hupA: s ursprungliga plats. HU-mCherry fungerar som en proxy för att följa nukleoiddynamiken i levande celler när den binder till DNA på ett icke-specifikt sätt. Inokulera 5 ml medium (här, 3-[N-morfolino] propansulfonsyrabaserat medium [MOPS]; Tabell 1, tabell 2 och tabell 3) kompletterat med glukos 0,4 % och ett selektivt antibiotikum (om så krävs) med en isolerad koloni i ett glasrör (≥25 ml) och placera röret i en skakinkubator inställd på 37 °C och 180 varv per minut (rpm) över natten (mellan 15 timmar och 19 timmar). Alternativt kan plaströr, glas eller plastkolvar (≥ 25 ml) användas istället för glasrör.OBS: MOPS-medium kompletterat med glycerol vid en slutlig koncentration av 0,4% användes under de experiment som beskrivs i detta papper, förutom de nattkulturer som utfördes i MOPS glukos 0,4%. Generationstiden för E. coli i MOPS kompletterad med glukos är kortare än i MOPS glycerol. Användning av MOPS glukos 0,4% istället för MOPS glycerol 0,4% vid detta steg säkerställer att cellerna når den stationära fasen inom 19 timmar. Andra tillväxtmedier, såsom M9 eller rich defined medium (RDM) kompletterat med distinkta kolkällor, kan också användas. Det bör dock noteras att tillväxthastigheten och persistensfrekvensen är olika beroende på vilket medium och/eller kol som används23. Följande morgon, centrifugera 1 ml kultur vid 2 300 x g i 3 minuter, kassera supernatanten och återsuspendera försiktigt pelleten i samma volym fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD 600 nm) och beräkna den volym som behövs för en initial OD600 nm på 0,01 i en slutlig volym på 2 ml. Placera 2 ml MOPS glycerol 0,4% medium i en brunn med en klar botten 24-brunnsplatta och inokulera med den beräknade odlingsvolymen över natten. Placera plattan med 24 brunnar i en automatisk mikroplattläsare (se Materialförteckning) för att övervaka OD600 nm i 24 timmar. Ställ in mikroplattläsaren på att mäta OD600 nm var 15:e minut vid en temperatur på 37 °C och med hög omloppsbana (140 rpm).OBS: Om stammen som används i experimentet kodar för en fluorescerande reporter, se till att dess tillväxthastighet är jämförbar med den för wt för att undvika artefakt i de efterföljande experimenten, eftersom tillväxthastigheten påverkar antibiotikapersistensfrekvensen23. På grund av detektionsbegränsningar vid mycket låga celldensiteter och de potentiella töjningsspecifika effekterna på förhållandet OD600 nm/colony forming units (CFU), rekommenderas att tillväxtkinetiken utvärderas genom övervakning av CFU·ml-1 vid arbete med okarakteriserade stammar. 2. Bestämning av den minsta hämmande koncentrationen av antibiotika OBS: Den minsta hämmande koncentrationen (MIC) definieras som den lägsta dosen av antibiotikum vid vilken ingen bakterietillväxt observeras. Bestämningen av MIC måste utföras för varje antibiotikum och stam. I de experiment som beskrivs här användes fluorokinolonantibiotikumet ofloxacin (OFX). Bestämningen av MIC möjliggör bekräftelse på att antibiotikumlösningen har framställts korrekt, antibiotikumet är aktivt och stammarna är lika känsliga för antibiotikumet. Här utfördes den publicerade agarutspädningsmetoden för att bestämma MIC till OFX för de olika stammarna som användes24. MIC för ett givet antibiotikum till en given bakteriestam kan också bestämmas via buljongutspädningsmetoden24. Beredning av plattorna för MIC-bestämningFörbered en stamlösning för antibiotikumet som används i experimenten genom att lösa 5 mg OFX i 1 ml ultrarent vatten. Tillsätt 20 μL 37% HCl för att öka lösligheten av OFX. Smält 100 ml steril LB-agar och håll den vid 55 °C för att undvika stelning. Bered sex små glasflaskor (25 ml) och pipettera 5 ml flytande LB-agarmedium i varje kolv med en steril pipett. Späd 10 μl av stamlösningen 5 mg·ml-1 OFX i 90 μl ultrarent vatten (spädning av stamstocken 1:10). Tillsätt 0 μl, 2 μl, 4 μl, 6 μl, 8 μl eller 10 μl av 500 μg·ml-1 OFX-lösningen till var och en av de sex glasflaskorna innehållande 5 ml LB-agarmedium för att generera LB-agarmedium med slutliga koncentrationer på 0 μg·ml−1, 0,02 μg·ml−1, 0,04 μg·ml−1, 0,06 μg·ml−1, 0,08 μg·ml−1 respektive 0,1 μg·ml-1 OFX. Blanda lösningen genom att rotera kolvarna flera gånger.OBS: Om MIC för antibiotikumet av intresse är känt, bör koncentrationsintervallet nå underifrån till över den faktiska MIC. Om MIC är okänd rekommenderas ett stort koncentrationsintervall med en log 2-spädningsserie. Se till att LB-agarmediet har svalnat innan du tillsätter antibiotikumet, eftersom höga temperaturer kan inaktivera det. Det är dock viktigt att inte låta LB-agarmediet stelna innan antibiotikan tillsätts, eftersom detta kan leda till en icke-homogen fördelning av antibiotikumet i LB-agarmediet. Häll 5 ml av vart och ett av de sex LB-agarmedierna som beretts i steg 2.1.3 på ett dosökningssätt i en 6-brunns odlingsplatta med en steril pipett. Låt agarn svalna tills den stelnat och torka plattan innan den används.OBS: Förbered antibiotikalösningen och odlingsplattan den dag analysen utförs. MIC-bestämningInokulera 5 ml LB-medium med en isolerad koloni i ett glasrör (≥25 ml) och placera glasröret i en skakinkubator inställd på 37 °C och 180 rpm över natten (mellan 15 timmar och 19 timmar). Följande morgon mäts OD600 nm och späds kulturen i ett provrör till en slutlig celldensitet på 1 x 107 CFU·ml-1 i PBS. För de stammar som testats här motsvarar 1 x 107 CFU·ml−1 en OD600 nm på 0,0125.Anmärkning: Om korrelationen mellan CFUml-1 och OD 600 nm inte är känd, bör tillväxtkurvan bestämd genom mätningar av CFU och OD 600 nm fastställas för att beräkna korrelationsfaktorn mellan CFU·ml-1 och OD 600 nm. Placera 2 μL av den tidigare utspädda kulturen på varje brunn på den torkade 6-brunnsplattan. Låt fläckarna torka innan plattan placeras i en inkubator vid 37 °C över natten (mellan 15 och 19 timmar). Nästa dag räknar du kolonierna som bildas i varje brunn. MIC motsvarar brunnen med minsta koncentration av antibiotikum där ingen bakterietillväxt detekteras. 3. Spot analys OBS: Spotanalysmetoden är ett kvalitativt tillvägagångssätt som möjliggör uppskattning av antalet livskraftiga celler (celler som kan generera kolonier efter antibiotikastress). Spottestet utförs före time-kill-testet för att ge insikter om viabiliteten hos den stam som används under de testade förhållandena och för att informera om de utspädningar som behövs under time-kill-testet (se avsnitt 4). För att förbereda LB-agarplattorna för punktanalyser, häll 50 ml LB-agar i en fyrkantig petriskål (144 cm2). Förbered en kvadratisk petriskål per tidpunkt. Låt LB-agarn stelna och torka plattorna före användning. Inokulera 5 ml medium (MOPS glukos 0,4%) med en isolerad koloni i ett glasrör (≥25 ml) och placera röret i en skakande inkubator inställd på 37 ° C och 180 rpm över natten (mellan 15 timmar och 19 timmar). Nästa dag mäts OD 600 nm och späds kulturen till färskt temperaturjusterat medium (37 °C, MOPS-glycerol 0,4%) i ett glasrör (≥25 ml) till en slutlig OD600 nm på ~0,001 . Låt kulturen växa över natten i en inkubator vid 37 °C vid 180 rpm (mellan 15 och 19 timmar). Mät OD 600 nm följande dag och inkubera kulturen till en slutlig OD600 nm på 0,3. Bered under inkubation plattor med 96 brunnar genom att placera 90 μl 0,01 MMgSO4-lösning i varje brunn utom brunnarna i första raden (rad A). Plattorna med 96 brunnar kommer att användas för 10-faldig serieutspädning i steg 3.7.OBS: I detta experiment testades två stammar (wt och hupA-mCherry-stammen ) i tre exemplar vid sju olika tidpunkter. Eftersom en platta består av 12 kolonner kan en platta användas för två tidpunkter, och därmed framställdes totalt fyra plattor. Dra ut 200 μl av varje bakteriekultur vid en OD600 nm på 0,3. Dessa prover motsvarar t0 (obehandlad) tidpunkt före antibiotikabehandlingen och möjliggör bestämning av CFU·ml-1 före antibiotikabehandling. Centrifugera proverna vid 2 300 x g i 3 minuter. Tillsätt önskad koncentration av OFX till vätskekulturen under centrifugeringstiden och fortsätt att inkubera vid 37 °C under skakning.OBS: Här användes OFX i en koncentration av 5 μg·ml-1 (motsvarande MIC multiplicerat 83-faldigt). I en tidigare studie användes denna koncentration för att karakterisera persistensfenomenet under OFX-exponering25. Den antibiotikakoncentration som används för tid / dödanalyser kan variera beroende på antibiotika, odlingsmedium och tillståndet för bakterietillväxt. Efter centrifugering suspenderas cellpelleten igen i 200 μl 0,01 MMgSO4-lösning . Placera 100 μl i den tomma brunnen på den platta med 96 brunnar som beretts i steg 3.5. Utför en utspädning genom att överföra 10 μL av brunnen i rad A till brunnen i rad B innehållande 90 μL 0,01 MMgSO4. Fortsätt serieutspädningarna genom att överföra 10 μl av brunnen i rad B till brunnen i rad C. Upprepa tills en utspädning på 10−7 uppnås (där varje överföring är en 10-faldig utspädning).OBS: I detta experiment testades sex kulturer (tre för wt-stammen och tre för hupA-mCherry-stammen ) för varje tidpunkt. Enligt protokollet används en mutikanalpipett för att utföra serieutspädningarna för de sex stammarna samtidigt. För att minimera det tekniska felet byts pipettspetsarna mellan varje överföring. Placera 10 μl av varje spädning på LB-agarplattorna som beretts i steg 3.1.OBS: En flerkanalig pipett används för att samtidigt upptäcka samma utspädning (t.ex. en 10−4 utspädning) för de sex kulturerna. Under spottningen bör det första stoppet på flerkanalspipetten användas utan att trycka på det andra stoppet, eftersom detta kan resultera i att mikrodroppar dispenseras på plattan. Dra upp 200 μl av kulturen vid relevanta tidpunkter efter tillsatsen av antibiotika och utför serieutspädningar enligt beskrivningen i steg 3.8. Spot 10 μL av varje spädning enligt beskrivningen i steg 3.9.OBS: För experimentet som beskrivs här samlades sju tidpunkter (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). För stammar som uppvisar ökad antibiotikakänslighet jämfört med WT kan flera tvättar i MgSO4 0,01 M utföras för att avlägsna kvarvarande antibiotika. Inkubera plattorna vid 37 °C över natten (mellan 15 och 19 timmar). Nästa dag, räkna antalet kolonier vid de två högsta utspädningarna för vilka kolonier kan detekteras. Idealt sett innehåller fläckarna på agarplattorna för dessa utspädningar mellan 3 och 30 kolonier som möjliggör noggrann bestämning av CFU·ml-1 för varje prov. Beräkna överlevnadskvoten genom att dividera den beräknade CFU·ml-1 för varje tidpunkt med CFU·ml-1 för den ursprungliga populationen vid t0. 4. Time-kill-analyser OBS: Medan punktanalyser är en lättanvänd metod för att uppskatta överlevnadshastigheten för en given stam för ett givet antibiotikum, ger tidsdödande analyser en överlevnadshastighet med högre upplösning och utförs för att exakt kvantifiera bakteriell livskraft. Profilen för dödskurvan kan användas för att bestämma om en given bakteriestam är känslig, tolerant eller resistent mot antibiotikumet i ett givet tillstånd. Dessutom möjliggör tidsdödande analyser bestämning av den tid för antibiotikaexponering som behövs för att detektera persistensfenomenet (början av den andra lutningen i den bifasiska dödskurvan) samt persistensfrekvensen. Förbered LB-agarplattor för time-kill plating-analysen. Häll 25 ml LB-agar i en petriskål (±57 cm2). Förbered minst två petriskålar per tidpunkt (två utspädningar per tidpunkt per stam är pläterade). Låt LB-agarn stelna och torka plattorna innan du lägger till fem till åtta sterila glaspärlor på varje platta. Invertera och märk plattorna enligt stam / tillstånd / tidpunkt.OBS: Glaspärlor tillåter spridning av bakterier på agarplattorna under steg 4.7 och steg 4.9. Alternativt kan cellerna dispergeras på agarplattan med hjälp av en spridare. Bered 10-faldiga glasrör i serieutspädning som innehåller 900 μl 0,01 MMgSO4-lösning för varje prov. Det antal utspädningsglasrör per prov som behöver beredas motsvarar de utspädningar som behövs för att påvisa kolonier i punkttestet. Inokulera 5 ml medium (MOPS glukos 0,4%) med en isolerad koloni i ett glasrör (≥25 ml) och placera röret i en skakande inkubator inställd på 37 ° C och 180 rpm över natten (mellan 15 timmar och 19 timmar). Efter 16 timmars tillväxt mäts OD 600 nm och späd kulturen till ett färskt temperaturjusterat medium (37 °C, MOPS-glycerol 0,4 %) i ett glasrör till en slutlig OD600 nm på ~0,001 . Låt kulturen växa över natten i en inkubator vid 37 °C vid 180 rpm (mellan 15 och 19 timmar). Mät OD 600 nm följande dag och inkubera kulturen till en slutlig OD600 nm på 0,3. Vid en OD 600 nm på 0,3 dras 100 μl av kulturen ut, späds enligt de data som erhållits i spotanalysen (vid en OD600 nm av 0,3 och utan antibiotika ger en 10−5 spädning vanligen 200-300 kolonier) och platta100 μL på LB-agarplattorna beredda i steg 4.1-4.2. Skaka försiktigt plattorna för att undvika att pärlorna kommer i kontakt med skålkanterna, eftersom detta kan leda till en icke-homogen spridning av bakteriecellerna på LB-agarmediet. Detta första prov före antibiotikabehandlingen motsvarar t0-tidpunkten (CFU·ml-1 före antibiotikabehandling). Tillsätt önskad koncentration av OFX och fortsätt inkubera vid 37 °C under skakning.OBS: Här användes OFX i en koncentration av 5 μg·ml-1 (motsvarande MIC multiplicerat 83-faldigt). Vid relevanta tidpunkter efter tillsatsen av antibiotikumet dras 100 μl av kulturen ut, späds ut enligt de data som erhållits i punkttestet och plattan 100 μl på LB-agarplattorna som beretts i steg 4.1–4.2. Platta cellerna enligt beskrivningen i steg 4.7.OBS: För experimentet som beskrivs här samlades sju tidpunkter (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). För stammar som uppvisar en ökad antibiotikakänslighet jämfört med vikten, kan flera tvättar i MgSO4 0,01 M utföras för att avlägsna kvarvarande antibiotika. Inkubera plattorna vid 37 °C över natten (mellan 15 och 19 timmar). Nästa dag, räkna antalet kolonier vid de två högsta utspädningarna för vilka kolonier kan detekteras. Helst bör plattorna innehålla 30-300 kolonier för att möjliggöra en noggrann bestämning av CFU · ml-1 i varje prov. Beräkna överlevnadskvoten genom att normalisera CFU·ml-1 vid varje tidpunkt med CFU·ml-1 vid t0. Plotta loggen10 normaliserad CFU·mL-1 som en funktion av tiden. 5. Mikrofluidisk time-lapse-mikroskopiavbildning OBS: I följande avsnitt beskrivs förberedelsen av mikrofluidikplattan samt tidsfördröjningsbildtagning och bildanalysprocedur. Syftet med detta experiment är att observera och analysera persistensfenotypen vid antibiotikabehandling på encellsnivå. De data som samlats in under detta experiment kan användas för att generera ett brett spektrum av resultat beroende på vilken fråga som behandlas och / eller de fluorescerande reportrarna som används under experimentet. I experimentet som beskrivs här utfördes kvantitativ analys av celllängden och HU-mCherry-fluorescens22, vilket återspeglar nukleoidorganisationen i persister- och icke-persisterceller. Bakteriell cellodling för mikrofluidisk time-lapse-mikroskopiInokulera 5 ml medium (MOPS glycerol 0,4%, kompletterat med ett selektivt antibiotikum om det behövs) med en isolerad koloni i ett glasrör (≥25 ml) och placera röret i en skakinkubator inställd på 37 ° C och 180 rpm över natten (mellan 15 timmar och 19 timmar). Nästa dag mäts OD 600 nm och späds kulturen i färskt temperaturjusterat medium (37 °C, MOPS glycerol 0,4%) i ett glasrör till en slutlig OD600 nm på ~0,001 . Låt kulturen växa över natten (mellan 15 och 19 timmar) i en skakinkubator vid 37 °C och 180 rpm för att få en tidig exponentiell faskultur nästa dag. Beredning av mikrofluidisk platta och time-lapse mikroskopi avbildningOBS: Mikrofluidiska experiment kan utföras i kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter (som beskrivs här) eller i internt producerade mikrofluidiska system.Ta bort konserveringslösningen (om sådan finns) från varje brunn på mikrofluidplattan och ersätt den med ett nytt odlingsmedium.OBS: Om mikrofluidikplattan innehåller en avfallsutloppsbrunn ska konserveringslösningen av utloppsbrunnen avlägsnas men inte ersättas av mediet. Försegla mikrofluidikplattan med grenrörssystemet genom att klicka på tätningsknappen eller genom mikrofluidikprogramvaran (välj först Verktyg, följt av Tätningsplatta).OBS: För att täta plattan bör ett jämnt tryck appliceras på plattan och grenröret genom att manuellt pressa plattan mot grenröret. Om det utförs korrekt ska anteckningen “förseglad” visas på ONIX2-gränssnittet. Det är viktigt att inte applicera något tryck på glasskivan för att undvika eventuell risk att bryta grenröret. När den är förseglad, utför en första primingsekvens (klicka på Kör flytande primingsekvens på mikrofluidikprogramvarugränssnittet).OBS: Run Liquid Priming Sequence motsvarar 5 min perfusion vid 6,9 kPa för brunnarna 1-5, följt av 5 min perfusion vid 6,9 kPa för brunn 8 och en slutlig perfusionsomgång för brunn 6 i 5 min vid 6,9 kPa. Run Liquid Priming Sequence gör det möjligt att avlägsna den bevarandelösning som fortfarande kan finnas i kanalerna som förbinder de olika brunnarna. Inkubera plattan i ett termostatstyrt skåp i mikroskopet vid önskad temperatur (här 37 °C) i minst 2 timmar innan mikroskopiavbildningen påbörjas. Starta en andra Run Liquid Priming Sequence innan du påbörjar experimentet. Försegla mikrofluidikplattan genom att klicka på Seal off på microfluidic software interface. Byt ut mediet i brunn 1 och brunn 2 med 200 μl färskt medium, i brunn 3 med 200 μl färskt medium innehållande antibiotikumet (här OFX vid 5 μg·ml−1), i brunn 4 och brunn 5 med 200 μl färskt medium, i brunn 6 med 200 μl färskt medium och i brunn 8 med 200 μl av odlingsprovet (från steg 5.1.2) utspätt till en OD600 nm på 0,01 i färskt medium. Försegla mikrofluidplattan enligt beskrivningen i steg 5.2.2 och placera plattan på mikroskopmålet inuti mikroskopskåpet.OBS: Se till att placera en droppe nedsänkningsolja på mikroskopmålet innan du placerar mikrofluidplattan. I mikrofluidikprogramvaran klickar du på Cellladdning för att tillåta cellladdning i mikrofluidplattan.OBS: Cellladdningssteget omfattar 15 s perfusion vid 13,8 kPa för brunn 8, följt av 15 s perfusion vid 27,6 kPa för brunn 6 och brunn 8, och en slutlig perfusionsomgång för brunn 6 för 30 s vid 6,9 kPa. Tätheten av cellerna i mikrofluidikplattan är avgörande för experimentet. Den första delen av detta mikrofluidiska protokoll består av att odla bakterier i 6 timmar i ett nytt medium före antibiotikabehandlingen. Efter 6 timmars tillväxt måste celldensiteten vara tillräcklig för att detektera de sällsynta persistercellerna (under de förhållanden som används i denna studie genererar persistercellerna med en frekvens av 10−4). Om celldensiteten är för hög är det svårt att skilja de enskilda cellerna, vilket förhindrar exakt encellsanalys. Eftersom tillväxthastigheten är direkt beroende av mediet bör tätheten av celler i mikroskopifälten bedömas innan experimentet inleds. Ställ in ett optimalt fokus med överfört ljusläge och välj flera intressanta regioner (ROI) där ett lämpligt cellnummer observeras (upp till 300 celler per fält).Välj minst 40 ROI för att se till att de sällsynta persistercellerna avbildas. På mikrofluidikprogramvaran klickar du på Skapa ett protokoll. Programmera injektionen av färskt medium vid 6,9 kPa i 6 h (brunn 1-2), följt av injektion av mediet innehållande antibiotikumet vid 6,9 kPa i 6 h (brunn 3) och slutligen injektion av färskt medium vid 6,9 kPa i 20 h (brunnar 4-5).OBS: En bakteriekultur utspädd till en OD600 nm på 0,01 tillåter bakterier att växa i mikrofluidikkammaren i 6 timmar, vilket säkerställer att cellerna befinner sig i exponentiell tillväxtfas. Beroende på antalet celler som förs in i den mikrofluidiska anordningen under laddningssteget (se steg 5.2.8) kan tillväxtfasens varaktighet anpassas för att erhålla upp till 300 celler per ROI. Eftersom persistens är ett sällsynt fenomen förbättrar ökningen av antalet celler per ROI möjligheten att observera persisterande celler. Cellantalet bör dock inte överstiga 300 celler per ROI, eftersom detta gör encellsanalys tråkig. Utför mikroskopiavbildning i time-lapse-läge med en bild var 15: e minut med överfört ljus och excitationsljuskällan för den fluorescerande reportern. Här användes en 560 nm excitationsljuskälla för mCherry-signalen (580 nm LED vid 10% effekt med filter 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] och 100 ms exponering för mCherry). Den Zeiss-kompatibla Zen3.2-programvaran användes för cellavbildning. BildanalysOBS: Öppningen och visualiseringen av mikroskopibilderna utförs med ImageJ / Fiji-programvaran med öppen källkod (https://fiji.sc/)26. Den kvantitativa bildanalysen utförs med hjälp av programvaran ImageJ/Fiji med öppen källkod och det kostnadsfria MicrobeJ-plugin-programmet (https://microbej.com)27. I detta protokoll användes MicrobeJ 5.13I (14) -versionen.Öppna ImageJ / Fiji-programvaran på datorn och dra hyperstack-time-lapse-mikroskopibilderna till Fiji-laddningsfältet. Använd Image > Color > Make Composite för att smälta samman de olika kanalerna i hyperstacken. Om kanalerna i tidsfördröjningsexperimentet inte motsvarar den önskade färgen (t.ex. om faskontrasten visas i rött istället för grått) använder du Bild > Färg > Ordna kanaler för att tillämpa rätt färg på kanalerna. Öppna MicrobeJ-plugin och upptäck bakteriecellerna med hjälp av det manuella redigeringsgränssnittet. Ta bort de automatiskt identifierade cellerna och skapa en ikon för de bevarade cellerna av intresse manuellt ram för bildruta.Olika inställningar kan användas för att automatiskt upptäcka enskilda celler. Manuell detektion användes här eftersom de analyserade persistercellerna bildar långa filament, som sällan detekteras korrekt med automatisk detektering. Efter identifieringen använder du ikonen Resultat i MicrobeJ manuella redigeringsgränssnitt för att generera en ResultJ-tabell. Spara ResultJ-filen och använd ResultJ-tabellen för att få insikter i olika parametrar av intresse för encellsanalysen. I detta protokolls fall exporterades medelfluorescensen för HU-mCherry-intensiteten, celllängden och cellarean för enskilda celler.

Representative Results

Som beskrivits ovan karakteriserades stammarna som användes för encellsfenotypisk analys av persisterceller i MOPS-glycerol 0,4% medium. Övervakningen av OD600nm över tid visade ingen skillnad mellan wt – och hupA-mCherry-stammarna (figur 1). Detta indikerar att uttrycket av fusionsproteinet HU-mCherry inte påverkade tillväxten under dessa förhållanden. Bakteriecellerna i båda stammarna som initialt inokulerades vid en OD600 nm av 0,01 nådde exponentiell fas ±8 h efter inokulering. MIC för OFX bestämdes med standardiserade metoder (här seriell agarutspädning)24. MIC definieras som den minsta koncentration där ingen synlig tillväxt detekteras. MIC för OFX för båda stammarna bestämdes till 0,06 μg·ml−1, vilket indikerar att hupA-mCherry-fusionen inte hade någon effekt på känsligheten för OFX jämfört med den isogena wt-stammen (figur 2). Vi bestämde vidare effekten av en dödlig OFX-behandling (83-faldig MIC) på livskraften hos båda stammarna som användes i denna studie. Eftersom antalet livskraftiga celler minskar med tiden vid OFX-exponering måste utspädningarna av bakteriekulturer justeras på lämpligt sätt för att nå 30 till 300 kolonier per platta. För att bestämma lämpliga utspädningar över tiden utfördes en spotanalys, där 10 μL från 0 till 10-7 seriella 10-faldiga utspädningar placerades på kvadratiska petriskålar med användning av en flerkanalig pipett. De lämpliga utspädningarna var de där isolerade kloner var synliga (t.ex. vid t0 = 10−5, t1h = 10−4/10−3, t4h = 10−2/10−1) (figur 3). Medan punktanalysen är en enkel metod för att få insikt i kinetiken för OFX-medierad dödande, misslyckas den med att exakt bestämma dödsdynamiken. När viabiliteten hos exponentiellt växande celler behandlade med OFX övervakades med time-kill-analysen observerades en typisk bifasisk kurva (figur 4). Kurvans första lutning återspeglar det snabba dödandet av den icke-persisterande populationen (röd streckad linje). Under de förhållanden som testades här kunde upp till 99,9% av cellerna inte bilda kolonier efter 3 timmar i närvaro av OFX. Denna första fas av dödande följs av en andra fas, som visar en långsammare dödshastighet (blå streckad linje), vilket avslöjar närvaron av läkemedelstoleranta persisterande celler. Under de testade förhållandena startade persisterfasen cirka 3 timmar efter OFX-tillsatsen, vilket belyser behovet av att exponera cellerna för OFX längre än 3 timmar för att undersöka persisterfenotyperna. Viktigt är att time-kill-kurvan visar att hupA-mCherry-fusionsproteinet inte hade någon effekt på tidsdödskinetiken. Den töjning som kodar för translationell fluorescerande fusion kan därför användas för att övervaka persistercellerna med hjälp av fluorescensmikroskopi. Vi fortsatte vidare med att undersöka persistensfenomenet på encellsnivå. För att göra det infördes hupA-mCherry-stammen i en mikrofluidisk platta, vilket möjliggjorde förändring av medelförhållanden (här tillväxt, behandling och återhämtning) medan time-lapse-mikroskopi utfördes på en given ROI. Under det första steget av det mikrofluidiska experimentet perfuserades cellerna som infördes i den mikrofluidiska anordningen med tillväxtmedium (MOPS glycerol 0,4%) och delades med en generationstid på ~ 2 h (figur 5 och figur 6). Denna första tillväxtfas indikerar att cellerna var livskraftiga och aktivt delade sig före OFX-behandlingen. Efter denna första tillväxtfas perfuserades cellerna med tillväxtmedium kompletterat med 5 μg·ml−1 OFX under 6 timmar. Så snart antibiotikumet nådde cellerna blockerades celldelningen (figur 5 och figur 6). Efter 6 timmars OFX-behandling perfuserades cellerna med färskt medium. Medan den stora majoriteten av cellerna inte kunde återuppta tillväxten (figur 5 och figur 6), kunde en liten subpopulation av bakterier förlänga och generera filamentösa celler25. Dessa celler, som kunde dela sig och generera livskraftiga dotterceller efter OFX-behandlingen, kan definieras som persistercellerna. Eftersom denna inställning möjliggör visualisering av persistercellerna före, under och efter behandling, ger den inte bara information om persisterfenotypen under återhämtningsfasen utan också om persistercellernas fysiologiska tillstånd före behandlingen (figur 6). Under de testade betingelserna delade sig persistercellerna på liknande sätt som icke-persisterande celler före OFX-behandlingen, vilket indikerar att de observerade persisterande cellerna inte härrörde från en vilande subpopulation (figur 6)25. Celllängdsanalysen av persisterceller under återhämtningsfasen avslöjade att varje filament hade en specifik töjningshastighet. Celllängden som nåddes av varje persister före den första delningen skilde sig från en persister till en annan. På samma sätt var tidpunkten för den första divisionshändelsen mycket heterogen (figur 6). Det delande persisterfilamentet genererade flera dotterceller, som började växa och dela sig för det mesta på samma sätt som obehandlade celler (figur 7). Den successiva delningen av filamentet resulterade sedan i en progressiv minskning av celllängden, vilket slutligen gav upphov till dotterceller med liknande celllängd som före OFX-behandlingen (figur 6 och figur 7B). Den stora majoriteten av cellerna kunde inte inducera filamentering efter OFX-avlägsnande. Denna stora cellpopulation motsvarar de döda cellerna (figur 5 och figur 6). Den fluorescerande fusionen av det nukleoidassocierade proteinet HU möjliggör visualisering av dynamiken hos nukleoid22. Analysen av den totala fluorescensintensiteten för HU-mCherry i cellen kan användas som proxy för DNA-halten22,25. Under tillväxtfasen (före OFX-behandling) varierade den totala mCherry-fluorescensintensiteten, vilket återspeglar dynamiken i kromosomreplikation och segregering under cellcykeln (figur 8). Efter OFX-tillsats ökade mCherry-fluorescensen vid mittcellen, vilket indikerar nukleoidkomprimering, vilket har visat sig induceras genom bildandet av dubbelsträngade DNA-brott28 (figur 5). Dubbelsträngade DNA-brott är en följd av verkningsmekanismen för OFX, som korrumperar typ II-topoisomeras-DNA-gyras och topoisomeras IV29,30. I E. coli är DNA-gyras det primära målet för OFX29,30. Genom att binda sitt mål vid ett kritiskt steg i dubbelsträngningsmekanismen hämmar OFX nedflyttningen av de klyvda DNA-strängarna, vilket i slutändan leder till frisättning av dubbelsträngade DNA-brott30. Som beskrivits ovan började persistercellerna till OFX-behandling att filamenta under återvinning25 (figur 6). Ökningen i celllängd korrelerade med en ökning av den totala mCherry-fluorescensintensiteten, vilket återspeglar replikationsstart och en ökning av nukleoidöverflödet i filamentet25 (figur 7a och figur 8). För döda celler förblev den totala mCherry-fluorescensintensiteten stabil under behandlingen och under återhämtningsfasen, vilket indikerar att dessa celler inte kunde replikera sina kromosomer efter OFX-borttagning (figur 8). Mikrofluidisk video (Video 1) av E. coli HU-mCherry-celler före, under och efter ofloxacinbehandling visas också. Figur 1: Tillväxtövervakning av wt – och hupA-mCherry E. coli-stammar. Optisk densitetsövervakning (OD600 nm) av wt (svart) och hupA-mCherry (röd). Nyanser och streckade linjer indikerar standardavvikelserna för de biologiska triplikaten. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 2: Bestämning av MIC för OFX för stammarna wt och hupA-mCherry E. coli. Wt () och hupA-mCherry (●) odlades i LB-medium och 2 μL sågs på seriella utspädningar av OFX-innehållande LB-agar (♦ koncentration indikerad i varje panel i μg·ml−1). Tillväxthämning är synlig vid minst 0,06 μg·ml−1. Figuren är ett representativt experiment av biologiska triplikater. Skalstång = 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 3: Spottest av wt – och hupA-mCherry E. coli-stammar vid exponering för OFX. (A) wt och (B) hupA-mCherry-stammarna odlades i MOPS-glycerol 0,4% enligt beskrivningen i protokollet (avsnitt 3), och de exponentiellt växande cellerna (OD600 nm = 0,3) behandlades med 5 μg·ml−1 OFX. T0 motsvarar tidpunkten före tillägget av OFX. T1, T2, T3, T4, T5 och T6 motsvarar 1-6 timmar efter OFX-tillsatsen. Figuren är ett representativt experiment av biologiska triplikater. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 4: Time-kill-test av wt – och hupA-mCherry E. coli-stammar vid exponering för OFX. Stammarna wt () och hupA-mCherry (●) odlades i MOPS-glycerol 0,4% enligt beskrivningen i protokollet (avsnitt 4), och de exponentiellt växande cellerna (♦ OD600 nm = 0,3) behandlades med 5 μg·ml−1 OFX. De streckade linjerna anger den första “snabba” (röda) avlivningsfasen och den andra “långsamma” (blå) avlivningsfasen, motsvarande de känsliga och långlivade subpopulationerna (erhållna genom linjär regression mellan T0 och T2 respektive mellan T3 och T6). Felstaplarna anger standardavvikelserna för de biologiska triplikaten. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 5: Representativa bilder av OFX-persistern och döda celler med hjälp av mikrofluidiska verktyg. Representativa mikroskopibilder som visar relevanta tidpunkter för det mikrofluidiska experimentet som utförts med hupA-mCherry-stammen (faskontrast i grått, HU-mCherry-signal i rött). Cellerna som uttrycker den märkta hupA-mCherry odlades i en mikrofluidisk platta (här 4 timmar), följt av en OFX-utmaning (5 μg·ml−1). Efter 6 h i närvaro av OFX perfuserades cellerna med färskt medium, vilket gjorde att persistercellerna kunde återhämta sig. Den persisterande cellen och dess avkomma under OFX-behandlingen och efter avlägsnande av OFX markeras i grönt respektive blått. Motsvarande tidpunkter anges på varje panel. Skalstapel = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 6: Mikroskopi time-lapse analys av längden på persister och döda celler. Celllängdsanalys av döda celler (i rött, n = 109) och persisterande celler (i grått, n = 13). Starten av OFX-behandlingen (5 μg·ml−1) indikeras av den röda streckade linjen (5 timmar) och OFX-avlägsnandet indikeras av den blå streckade linjen. Insatsen motsvarar tillväxtfasen före OFX-tillsats. Experimenten utfördes i tre exemplar. Nyanser och streckade linjer anger standardavvikelserna för den döda cellpopulationen (n = 109). Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 7: Tidsfördröjningsanalys av mikroskopi av en representativ persister för OFX. a) Kymograf för en representativ OFX-persister och dess dotterceller genererade genom filamentdelning under 8,5 timmar efter avlägsnande av OFX (18,5 timmar efter början av det mikrofluidiska experimentet, omfattande 4 timmars tillväxt, 6 timmar 5 μg·ml−1 OFX-behandling och 8,5 timmars återhämtning efter OFX-avlägsnande ). En bildruta motsvarar 15 min. Skalstapel = 5 μm. (B) Mask genererad från persisterkymografen i A. Den övervakade persistercellen indikeras med en blå kontur och dottercellerna markeras i distinkta färger. (C) Schematisk representation av persistercellinjen genererad från B. Färgkodningen är identisk med B. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 8: Celllängd och mCherry-fluorescensanalys av representativa persisterande och döda celler. Analys av celllängden (vänster axel) och den totala fluorescensintensiteten för HU-mCherry (höger axel, visas i godtyckliga enheter) för en representativ persister (heldragna svarta och röda linjer) och en representativ död cell (streckad svart och röd linje) under det mikrofluidiska timelapse-experimentet. Starten av OFX-behandlingen (5 μg·ml−1) indikeras av den röda streckade linjen och OFX-avlägsnandet av den blå streckade linjen. Klicka här för att se en större version av denna figur. Video 1: Mikrofluidisk video av E. coli HU-mCherry-celler före, under och efter ofloxacinbehandling. Mikrofluidisk time-lapse-avbildning som visar HU-mCherry-celler. Cellerna odlades i 4 timmar i MOPS glycerol 0,4%. Efter 6 timmars OFX-behandling (5 μg·ml−1) perfuserades det antibiotikafria mediet i mikrofluidikplattan för att persisterande celler skulle kunna återhämta sig. Skalstång = 5 μm. Tid (i min) anges. Tillväxt- och återhämtningsfaserna indikeras med “MOPS- Gly. 0,4%” och OFX-behandlingen med “OFX 5 μg/ml”. Klicka här för att ladda ner den här videon. 10x MOPS Stamlösning Volym stamlösning för 1 L 10x MOPS Slutlig koncentration i 10x MOPS-bas MOPS syra 1 M (justerat till pH 7,4 med KOH) 400 ml 0,4 meter Tricin 1 M (justerat till pH 7,4 med KOH) 40 ml 0,04 meter FeSO4.7H2O 0,01 meter 10 ml 0,0001 meter NH4Cl 1,9 meter 50 ml 0,095 meter K2SÅ4  0,276 meter 10 ml 0,00276 meter CaCl2.2H 2O 0,0005 meter 10 ml 0,000005 meter MgCl 2.6H2O 0,528 meter 10 ml 0,00528 meter NaCl tillsätt direkt 29,2 g 0,5 meter Destillerat vatten 460 ml Mikronäringsämnen 1000x (se tabell 2) 10 ml Tabell 1: Sammansättning av 10x MOPS. Mikronäringsämnen 1000x Koncentration i Micronutriments 1000x stamlösning Slutlig koncentration i 10x MOPS-bas (NH4)6Mo7O24.4H2O: 0,000003 meter 0,00000003 miljoner H3BO3 0,0004 meter 0,000004 meter CoCl2.6H 2O 0,00003 meter 0,0000003 miljoner CuSO4.5H 2O 0,00001 meter 0,0000001 M MnCl 2.4H2O 0,00008 meter 0.0000008 M ZnSO.7H2O 0,00001 meter 0.0000001M Tabell 2: Sammansättning av 1 000x mikronäringsämnen. MOPS glukos 0,4% eller MOPS glycerol 0,4% Stamlösning Volym för 1 L MOPS glukos 0,4 % eller MOPS glycerol 0,4 % Slutlig koncentration i MOPS glukos 0,4% eller MOPS glycerl 0,4% 10x MOPS se tabell 1 100 ml K2HPO4 0,132 meter 10 ml 0,00132 meter Glukos (för MOPS glukos 0,4%) 20% (20 g i 100 ml destillerat vatten) 20 ml 0.40% Glycerol (för MOPS glycerol 0,4%) ≤99% 4 ml 0.40% Destillerat vatten 870 ml för MOPS glukos 0.4% eller 886 ml för MOPS glycerol 0.4% Tabell 3: Sammansättning av MOPS glukos 0,4% och MOPS glycerol 0,4%.

Discussion

Protokollet som presenteras i detta dokument möjliggör analys av persistensfenotypen som observerats som svar på antibiotikabehandling på populations- och encellsnivå. Experimenten utfördes med E. coli MG1655-stammen, som odlades i ett kemiskt definierat medium (MOPS-glycerol 0,4%). Time-kill analyser och mikroskopiexperiment utfördes på exponentiella faskulturer. Vi använde OFX, en fluorokinolon, i en koncentration av 5 μg · ^ml-1 för att avslöja de persisterande cellerna. De tillvägagångssätt som beskrivs här kan tillämpas på andra bakteriedödande antibiotika, såsom β-laktamer, aminoglykosider eller antimikrobiella föreningar³¹. Följaktligen kan andra bakteriestammar, media eller tillväxtförhållanden användas. Övervakning av olika fluorescerande fusioner i en liknande inställning som den som beskrivs här kan vara användbar för att följa cellulära processer såsom DNA-replikation³², DNA-reparation^25,33 och celldelning³⁴ före^, under och efter antibiotikabehandlingen. På samma sätt kan fluorescerande reportrar utnyttjas för att undersöka distinkta aspekter av cellfysiologi, såsom intracellulära pH³⁵, ATP³⁶ eller ROS^37-nivåer. Alternativt till fluorescerande fusioner kan kemiska färgämnen också appliceras. Till exempel kan hupA-mCherry-fusionen ersättas med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), ett fluorescerande färgämne som färgar DNA³⁸. Att utföra time-lapse-mikroskopi i kombination med sådana fluorescerande färgämnen bör dock undvikas, eftersom dessa färgningstekniker kan störa cellcykelns dynamik under time-lapse-experiment. Alternativt kan sådana experiment ersättas med tidsförloppsanalyser av snap-shot-avbildning vid relevanta tidpunkter.

Även om sådana fluorescerande reportrar är till hjälp, bör mängden information som kan extraheras genom analys av faskontrastbilder inte försummas. Här övervakade vi celllängdsutvecklingen under tillväxt-, OFX-behandlings- och återhämtningsstadierna. Andra parametrar baserade på faskontrastbilder, såsom cellbredd, faskontrastintensitet och krökningar av bakteriecellerna, kan också extraheras med lätthet genom att använda adekvat programvara, såsom MicrobeJ²⁷.

Sammanfattningsvis kan proceduren som beskrivs här tillämpas på andra tillstånd och bakteriearter för att övervaka cellulära svar på förändrade miljöer eller stressfaktorer^18,19. Genom att använda andra fluorescerande reportrar (transkriptionella och translationella reportrar, kemiskt färgämne) i kombination med en populationsanalys, såsom flödescytometri/FACS, kan intressanta frågor behandlas i ett flerskaligt ramverk.

Materials

Axio Observer	Zeiss		Inverted fluorescence microscope
CaCl2.2H2O	Merck	1.02382.0250	For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
CellASIC ONIX Microfluidic System	Merck	CAX2-S0000	Microfluidic system
CellASIC ONIX2 FG	Merck	ONIX2 1.0.1	Microfluidic software
CellASIC ONIX2 Manifold Basic	Merck	CAX2-MBC20	Manifold system
CoCl2.6H2O	Merck	1.02539.0100	For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
CuSO4.5H2O	Merck	1.02790.0250	For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
D-(+)-glucose	Sigma Aldrich	G7021-1KG	Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)		BE10	wt reference strain, lab strain
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT		BE16	HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain
FeSO4.7H2O	VWR Chemicals	24244.232	For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Fiji	ImageJ	https://fiji.sc/	Image software; Schindelin et al. if used in publication
Glycerol	Merck	56815	Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium
Greiner CELLSTAR® multiwell culture plate	Merck	M8812-100EA	24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader
H3BO3	Sigma-Aldrich	B6768-1KG	For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera	Hamamatsu	C13440-20CU	Digital Image Acqusition
K2HPO4	Merck	1.05099.1000	For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
KOH	Merck	1.05029.1000	For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
K2SO4	Merck	1.05153.0500	For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Luria-Broth agar medium	Invitrogen	22700041	Growth medium for plating assay
Luria-Broth medium	Invitrogen	12780029	Growth medium for MIC determination
MgCl2.6H2O	Merck	1.05832.1000	For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
MgSO4	Merck	7487-88-9	Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM
MicrobeJ	Imagej/Fiji plugin	https://www.microbej.com/	Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters.
Microfluidic Plates CellASIC ONIX	Merck	B04A-03-5PK	Plate for microfluidic system
MnCl2.4H2O	Merck	1.05927.0100	For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
MOPS, Free Acid ULTROL® Grade	Merck	475898-500GM	For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
NaCl	SIgma-Aldrich	S5886-1KG	For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
(NH4)6Mo7O24.4H2O	Merck	1.01180.0250	For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
NH4Cl	Merck	1.01145.0500	For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Ofloxacin	Merck	82419-36-1	Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x	Merck	P3813	Dilution buffer
GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer	Thermofisher Scientific	840-208200	UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm
SoftMax Pro	Molecular Devices		Microplate reader software
SpectraMax i3x	Molecular Devices		Microplate reader
N-[Tris(hydroxyméthyl)-méthyl]-glycine	Merck	1.08602.0250	For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Zeiss® immersion Oil 518F	Zeiss		Immersion oil to increase resolution of microscope
Zen3.2 Pro	Zeiss		Microscopic image acquisition and processing software
ZnSO4.7H2O	Merck	1.08883.0500	For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium