Isolierung ruhender Stammzellpopulationen aus einzelnen Skelettmuskeln
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Muskelstammzellen und fibro-adipogenen Vorläuferzellen aus einzelnen Skelettmuskeln bei Mäusen. Das Protokoll umfasst die Dissektion einzelner Muskeln, die Isolierung von Stammzellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, die Reinheitsbewertung durch Immunfluoreszenzfärbung und die quantitative Messung des S-Phaseneintritts mittels 5-Ethinyl-2′-Desoxyuridin-Inkorporationsassay.
Abstract
Die Skelettmuskulatur beherbergt verschiedene Populationen adulter Stammzellen, die zur Homöostase und Reparatur des Gewebes beitragen. Skelettmuskelstammzellen (MuSCs) haben die Fähigkeit, neue Muskeln zu bilden, während fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) zum stromalen Stützgewebe beitragen und die Fähigkeit haben, Fibroblasten und Adipozyten zu bilden. Sowohl MuSCs als auch FAPs befinden sich in einem Zustand des verlängerten reversiblen Zellzyklusaustritts, der als Ruhezustand bezeichnet wird. Der Ruhezustand ist der Schlüssel zu ihrer Funktion. Ruhende Stammzellen werden üblicherweise aus mehreren Muskelgeweben gereinigt, die in einer einzigen Probe zusammengefasst sind. Neuere Studien haben jedoch deutliche Unterschiede in den molekularen Profilen und der Ruhetiefe von MuSCs gezeigt, die aus verschiedenen Muskeln isoliert wurden. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Untersuchung von MuSCs und FAPs aus einzelnen Skelettmuskeln und stellt Strategien zur molekularen Analyse der Stammzellaktivierung vor. Es wird detailliert beschrieben, wie Muskeln unterschiedlichen Entwicklungsursprungs, Dicke und Funktionen isoliert und verdaut werden, wie z. B. Zwerchfell, Trizeps, Gracilis, Tibialis anterior (TA), Gastrocnemius (GA), Soleus, Extensor digitorum longus (EDL) und die Massetermuskeln. MuSCs und FAPs werden mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) aufgereinigt und mittels Immunfluoreszenzfärbung und 5-Ethinyl-2′-Desoxyuridin (EdU)-Inkorporationsassay analysiert.
Introduction
Die Skelettmuskulatur hat aufgrund des Vorhandenseins von Muskelstammzellen (MuSCs) eine hohe Regenerationsfähigkeit. MuSCs befinden sich auf den Myofasern unterhalb der Basallamina und befinden sich in einem Ruhezustand mit verlängertem, reversiblem Zellzyklusausgang 1,2,3,4. Bei einer Verletzung werden MuSCs aktiviert und treten in den Zellzyklus ein, um amplifizierende Vorläuferzellen entstehen zu lassen, die sich differenzieren und zu neuen Myofasern verschmelzen können 2,5. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass MuSCs für die Muskelregeneration absolut essentiell sind 6,7,8. Darüber hinaus kann ein einzelner MuSC sowohl neue Stammzellen als auch neue Myofasern transplantieren und erzeugen9. Die Skelettmuskulatur beherbergt auch eine Population von mesenchymalen Stromazellen, die als fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) bezeichnet werden und eine entscheidende Rolle bei der Unterstützung der MuSC-Funktion während der Muskelregeneration spielen 6,10,11,12.
Aufgrund ihres Potenzials, die Muskelregeneration zu koordinieren, besteht ein enormes Interesse daran, zu verstehen, wie MuSCs und FAPs funktionieren. Ruhende MuSCs werden durch die Expression der Transkriptionsfaktoren Pax7 und Sprouty1 sowie des Calcitoninrezeptors des Zelloberflächenproteins markiert, während ruhende FAPs durch den Zelloberflächenprotein-Platelet-derived growth factor receptor alpha (PDGFRa) gekennzeichnet sind10,12,13,14,15. Frühere Studien haben gezeigt, dass MuSCs und FAPs mit Hilfe von Zelloberflächenmarkern und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) aus der Skelettmuskulatur gereinigt werden können9,15,16,17,18,19,20,21. Während diese Protokolle die Fähigkeit, MuSCs und FAPs zu untersuchen, erheblich verbessert haben, besteht ein Nachteil darin, dass die meisten dieser Protokolle die Isolierung von MuSCs aus einem Pool verschiedener Muskelgewebe erfordern. Neuere Arbeiten von uns und anderen haben Unterschiede im Zellphänotyp und in der Genexpression zwischen MuSCs aufgezeigt, die aus verschiedenen Geweben isoliert wurden22,23. MuSCs aus dem Zwerchfell, dem Trizeps und den Gracilien zeigen eine schnellere Aktivierung als MuSCs aus den Muskeln der unteren Hintergliedmaßen22, während MuSCs aus dem extraokularen Muskel eine schnellere Differenzierung zeigen als MuSCs aus dem Zwerchfell und den Muskeln der unteren Hintergliedmaßen23.
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von MuSCs und FAPs aus einzelnen Skelettmuskeln (Abbildung 1). Dazu gehören die Dissektion des Zwerchfells, des Trizeps, des Gracilis, des Tibialis anterior (TA), des Soleus, des Extensor digitorum longus (EDL), des Gastrocnemius (GA) und des Massetermuskels. Präparierte Muskeln werden anschließend durch enzymatische Verdauung mit Kollagenase II (eine Protease, die spezifisch auf die Pro-X-Gly-Pro-Aminosequenz im Kollagen abzielt und den Abbau von Bindegewebe und Gewebedissoziation ermöglicht24) und Dispase (eine Protease, die Fibronektin und Kollagen IV spaltet und so eine weitere Zelldissoziation ermöglicht25) dissoziiert). MuSCs und FAPs werden mittels FACS aus Einzelzellsuspensionen isoliert. Als Beispiele für nachgeschaltete Assays für die Zellanalyse wird die Stammzellaktivierung durch den Einbau von 5-Ethinyl-2′-Desoxyuridin (EdU) bestimmt, während die Zellreinheit durch Immunfluoreszenzfärbung für die zelltypspezifischen Marker Pax7 und PDGFRa bestimmt wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mehrere Schritte sind bei der Ausführung dieses Protokolls entscheidend, um gute Erträge zu erzielen. Die einzelnen Muskeln haben ein kleines Volumen im Vergleich zu der Muskelmenge, die bei Bulk-Isolationsprotokollen verwendet wird. Dadurch besteht die Gefahr, dass der Muskel während der Dissektion austrocknet, was die Ausbeute verringert. Um dies zu verhindern, ist es wichtig, den Muskeln unmittelbar nach der Präparation Medium zuzuführen. Wenn die Präparation länger dauert, kann die Haut von einer Gliedmaße na…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Zellsortierung wurde an der FACS Core Facility der Universität Aarhus, Dänemark, durchgeführt. Die Figuren wurden mit Biorender.com erstellt. Wir danken Dr. J. Farup für die Bereitstellung des Kaninchen-Anti-PDGFRa-Antikörpers. Diese Arbeit wurde durch einen AUFF Starting Grant an E.P. und Start Package Grants von NovoNordiskFonden an E.P. (0071113) und an A.D.M. (0071116) unterstützt.
Materials
| 1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL tube |
| 15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS tube without strainer cap |
| 5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | FACS tube with strainer cap |
| 5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL tube |
| 50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus University | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Cell Proliferation Kit |
| Collagen from calf-skin | Bioreagent, Sigma Aldrich | Source: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Collagenase type II | Worthington, Fisher Scientific | Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Donkey serum (non-sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight forceps with fine tips |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Curved forceps |
| F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Glacial acetic acid (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Head over head mini-tube rotator | Fisher Scientific | 15534080 (Model no. 88861052) | Head over head mini-tube rotator |
| Horse serum | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Shaking water bath |
| MS2 mini-shaker | IKA | Vortex unit | |
| Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G needle |
| Neutral formalin buffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Cell strainer |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 primary antibody | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720) | |
| Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Pipette tips p10 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2140-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p200 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2069-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Protective underpad | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 layers |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
| Scalpel blade no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
| Scanlaf mars | Labogene | class 2 cabinet: Mars | Flow bench |
| ScanR | Olympus | Microscope, Core facility Aarhus University | |
| Scissors | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubator |
| Serological pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, non-pyrogenic |
| Serological pipette 5 mL | VWR, Avantor delivered by VWR | 612-3702 | Sterile, non-pyrogenic |
| Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Syringe |
| TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
| Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-well Half bottom plate |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
Referências
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