Påvisning av unormalt prionprotein ved immunhistokjemi

Summary

Immunmerking av unormalt prionprotein ved bruk av immunhistokjemiske protokoller krever spesifikke prøve- og anti-PrP-antistoffpreparasjonsmetoder. Den nåværende protokollen beskriver de viktigste trinnene i epitopdemasking for å sikre riktig PrP-immunmerking og for å minimere uspesifikk bakgrunnsfarging. Også denne tilnærmingen vurderer biosikkerhetstiltak når man utfører immunhistokjemiske studier med prioninfiserte vev.

Abstract

Unormale prionproteiner (PrP^Sc) er den sykdomsassosierte isoformen av cellulært prionprotein og diagnostiske markører for overførbare spongiforme encefalopatier (TSE). Disse nevrodegenerative sykdommene påvirker mennesker og flere dyrearter og inkluderer skrapesyke, zoonotisk bovin spongiform encefalopati (BSE), kronisk sløsende sykdom av hjortedyr (CWD) og den nylig identifiserte kamelprionsykdommen (CPD). Diagnostisering av TSE er avhengig av immundeteksjon av PrP^Sc ved bruk av både immunhistokjemi (IHC) og vestlige immunoblotmetoder (WB) på encefalonvev, nemlig hjernestammen (obex-nivå). IHC er en mye brukt metode som bruker primære antistoffer (monoklonal eller polyklonal) mot antigener av interesse i celler i en vevsseksjon. Antistoff-antigenbindingen kan visualiseres ved en fargereaksjon som forblir lokalisert i området av vevet eller cellen der antistoffet ble målrettet. Som sådan, i prionsykdommer, som i andre forskningsfelt, brukes immunhistokjemiteknikkene ikke bare til diagnostiske formål, men også i patogenesestudier. Slike studier innebærer å oppdage PrP^Sc-mønstre og -typer fra de som tidligere er beskrevet for å identifisere de nye prionstammene. Siden BSE kan infisere mennesker, anbefales det at biosikkerhetslaboratoriet nivå-3 (BSL-3) fasiliteter og / eller praksis brukes til å håndtere storfe, små drøvtyggere og hjortedyrprøver som inngår i TSE-overvåkingen. I tillegg anbefales oppsamlingsutstyr og prion-dedikert utstyr, når det er mulig, for å begrense forurensning. PrP^Sc IHC-prosedyren består av et maursyre-epitop-demasking trinn som også fungerer som et prioninaktiveringsmål, da formalinfiksert og parafininnebygd vev som brukes i denne teknikken forblir smittsomt. Ved tolkning av resultatene må det utvises forsiktighet for å skille uspesifikk immunmerking fra målmerking. For dette formålet er det viktig å gjenkjenne artefakter av immunmerking oppnådd i kjente TSE-negative kontrolldyr for å skille de fra spesifikke PrP Sc-immunmerkingstyper, som kan variere mellom TSE-stammer, vertsarter og prnp-genotype, nærmere beskrevet her.

Introduction

Ifølge prionhypotesen er den unormale isoformen (PrP^Sc) den primære eller eneste komponenten av det smittsomme stoffet i overførbare spongiforme encefalopatier (TSE). Bekreftelse for diagnostisering av TSE er avhengig av immundeteksjon av PrP^Sc ved bruk av immunhistokjemi (IHC) protokoller og / eller vestlige immunoblotmetoder (WB) av encephalon vev¹.

IHC er en metode som benytter monoklonale eller, i noen tilfeller, polyklonale antistoffer (som primære antistoffer) som et første skritt i immunfarging av spesifikt målrettede antigener av interesse lokalisert i celler i en vevsseksjon. Enhver effektiv primær antistoff-antigenbinding visualiseres deretter ved bruk av sekundære antistoffer som er spesifikke for de primære antistoffene. Disse sekundære antistoffene konjugeres til enzymer, slik som pepperrotperoksidase (HRP) eller alkalisk fosfatase (AP). Visualisering oppnås deretter ved å legge til et substrat til disse enzymene, og produsere uoppløselige fargeprodukter lokalisert i områder der de primære antistoffene er bundet til de målrettede antigenene. Forbedret visualisering kan oppnås ved motfarging, hvor et fargestoff brukes til å skape en kontrast mellom immunmerket og ikke-immunmerket vev².

Med IHC ved bruk av formalinfast parafininnebygd vev (FFPE), kan formalinfiksering oppheve effektiviteten av primære antistoffer på grunn av kryssbinding ved formaldehyd og oppvarming og dehydrering under parafininnbygging. Disse endrer konformasjonen av proteiner, ødelegger, denaturerer eller maskerer epitopene, og reduserer eller opphever dermed deres deteksjon³. Som sådan krever dette antigengjenfinning (AR). AR-teknikkene forstyrrer formaldehydrelatert kjemisk gruppe-kryssbinding i de antigene molekylene, og gjenoppretter eller avdekker dermed den opprinnelige antigen-proteinkonformasjonen. Dette resulterer i gjenoppretting av antistoff-antigen (epitop) affinitet for immunmerking. Den endelige effekten av AR avhenger av egenskapene til det målrettede antigenet og / eller det primære antistoffet².

Heat-induced antigen (epitope) retrieval (HIER) er en prosedyre for AR³ og brukes rutinemessig for PrP^Sc IHC-deteksjon, som beskrevet her. IHC er avgjørende for diagnose og brukes i forskningslaboratorier for å bestemme vevsfordelingen av et patologiassosiert antigen. Det er mye brukt i diagnostisering og forskning på kreft, nevrovitenskap og smittsomme sykdommer⁴, blant andre. For TSE spiller IHC en viktig rolle i diagnostisering og forskning for å bekrefte og undersøke PrP^{Sc-distribusjon} i naturlige verter og eksperimentelle modeller. IHC bidrar til prionpatogenesestudier og analyse av PrP Sc-avsetningstyper og mønstre, nemlig i nevrale vev⁵, for å oppdage avvik fra rutinemessig beskrevne infeksjoner og identifisere antatte nye prionstammer.

Fordi prioner av bovin spongiform encefalopati (BSE) kan infisere mennesker, kan visse laboratorieprotokoller involvert i arbeidet med BSE kreve bruk av BSL-3-fasiliteter og praksis⁶. Disse inkluderer bruk av en forseglet sekundær beholder for å transportere potensielle BSE-infiserte vevsprøver i instituttet og laboratoriet. Det inkluderer også utpeking av inneslutningsområder og prion-dedikert utstyr for BSE-forskning og analyse når det er mulig. Dette gjøres for å forhindre forurensning utenfor arbeidsområdet og gi et begrenset rom siden dekontamineringsprosedyrer blir nødvendige.

Følgelig følger laboratoriet for patologi av INIAV anbefalte biosikkerhetsnivå-3 (BSL-3) fasiliteter og praksis⁶ for å håndtere potensielle prioninfiserte prøver av vev fra storfe, små drøvtyggere og hjortedyr forbundet med TSE-overvåkingen.

Formalinfiksert og parafininnebygd vev som inngår i TSE-diagnostiske eller forskningsprosedyrer, spesielt i sentralnervesystemet, kan være potensielt smittsomt. Derfor må disse faste vevene behandles med maursyre for å redusere smittsomheten til prioner, hvis tilstede, før vevsbehandling. Dette utføres ved å plassere faste, trimmede vev (ca. 2-4 mm tykkelse) i en prosesseringskassett. Kassetten senkes deretter ned i 98% maursyre (i 1 time). Etter nedsenking vaskes kassettene med vev i rennende vann fra springen i 30 minutter, og returneres til fikseringsmiddelet før videre behandling. Dersom vevssnitt ikke behandles før behandling, må postmikrotomiske vevssnitt senkes ned i ufortynnet maursyre i minst 5 minutter før histologisk farging⁷. IHC-protokollen for PrP^Sc inkluderer et rutinemessig maursyre-epitop-demasking trinn, som også tjener til å inaktivere prioner⁷. Etter disse prioninaktiveringstrinnene kan de resulterende faste vevene deretter behandles ved BSL-2 ved hjelp av standard BSL-2-praksis.

Minimumskravet til vevsprøvetaking for TSE-diagnose hos dyr som inngår i TSE-overvåking, er innsamling av hjernestammen (på obexnivå). For å påvise atypisk BSE og skrapesyke anbefales det i tillegg at en del av lillehjernen også samles ^1,8. For CWD-diagnose bør både hjernestamme (obex) og retropharyngeale lymfeknuter testes, da PrP Sc kan påvises i lymfoid vev uten påviselig PrP^Sc i obex⁹, gjennomgått av Machado et ^al.10.

Obex-delen av hjernestammen inkluderer diagnostiske TSE-målsteder, nemlig den dorsale vagalkjernen (DVN), ensomhetskjernen (STN) og spinalkanalkjernen i trigeminusnerven (V). Disse områdene presenterer konsekvent bilateral PrP^{Sc-akkumulering} , selv i de tidlige stadiene av BSE og klassisk skrapesyke. I kliniske tilfeller av avansert TSE viser alle gråsubstansområdene i hjernestammen utbredt PrP^{Sc-distribusjon 11}.

Før snitting og prosessering evalueres hjerneprøvene (figur 1) for å fastslå grad av autolyse og tilstedeværelse av eventuelle vevsskader som potensielt kan svekke prøvens egnethet for IHC-basert bekreftende diagnose⁸. For å validere integriteten til de forberedende protokollene og analyseresultatene, er TSE-positive og negative vevsprøver inkludert som kontroller i forbindelse med fremstilling av vev fra testtilfeller i hver analyse.

Figur 1: PrP^Sc IHC-prosedyren. Representasjon som viser trinnvis sekvens av PrP^Sc IHC-prosedyre fra deparaffinisering av vevsseksjoner til eventuell immunfarging og deteksjon (FFPE – Formalin-fixed paraffin-embedded; Mab – monoklonalt antistoff; DAB – 3,3′ diaminobenzidin). Denne figuren ble opprettet i BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

IHC-prosedyren beskrevet her er en del av forskningsprosjektet FAIRJ-CT98-7021, “Etablering av et europeisk nettverk for overvåking av drøvtyggende TSE og standardisering og harmonisering av prosessen og kriterier for identifisering av mistenkelige tilfeller”. Det følger de diagnostiske kriteriene definert av Verdens dyrehelseorganisasjon, WOAH (tidligere kalt Office International des Épizooties, OIE)1 og European Reference Laboratory for animal TSEs 8,11.<su…

Representative Results

Gitt at ikke-spesifikk immunmerking er mulig, er det viktig å fastslå nivået av uspesifikk immunmerking hos kjente TSE-negative kontrolldyr. Dette er et viktig skritt for å tolke spesifikk PrPSc-immunmerking 7 (figur 2) riktig. Ikke-målmerking av anti-PrP-antistoffer har blitt observert å forekomme som diskret intranevronal finpartikkelfarging (tydeligere i hypoglossalkjernen og tilbehørskileatkjernen), uregelmessige finlineære flekktråde…

Discussion

TSE er potensielle zoonotiske sykdommer. Etter fremveksten av BSE i 1986 i Storbritannia, ble Portugal en av EUs medlemsstater med en høyere forekomst av denne sykdommen^14,15. For å kontrollere denne sykdommen, andre TSE som har dukket opp (klassisk og atypisk skrapesyke, BSE-varianter, og for tiden overvåking av skrantesyke hos hjortedyr), ble overvåkingsmekanismer utviklet av Generaldirektoratet for mat og veterinær (DGAV) og Nasjonalt institutt for landbr…

Materials

Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010	Undituled
			Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water
Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase	Vector Laboratories	PK-6100	Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing.
Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L)	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections.
Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase	Vector Laboratories	SK-4100	Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section.
DakoCytomation Pascal pressure chamber	DAKO	S2800
Ehrlich’s Hematoxylin:
Hematoxylin	Merck	115938	Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use.
Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010
Glacial acetic acid	Merck	101830
Potassium alum	Merck	1.01047.1000
Glycerin	Merck	1.04091.1000
Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2):			40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use
Hydrogen peroxide (30% w/w)	Scharlau	HI0136
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Formic acid 98%	Merck	1.00264.1000	Undiluted
Microtome	Shandon-AS325	Microtome	Shandon-AS325
Mounting medium Entellan	Merck	107960	Ready- to- use.
Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum	Gibco	16050-122	Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section).
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time.
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10	Cayman  Chemical Company	189710	PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11
Shandon CoverplateTM chamber	Thermo Scientific	72110017
Shandon Sequenza® Immunstaining center	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack	Thermo Scientific	73310017
Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1):			2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate  and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day.
Tri-sodium citrate dihydrate	Sigma-aldrich	S4641-500G
Citric acid	Sigma Aldrich	C0759
Staining jar and basket	Deltalab	19360
		19361
Superfrost Plus microscope slides	VWR	631-0108
Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):			10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day.
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Sodium Chloride (NaCl)	Merck	106404
Xylene	Panreac Applied Chem ITW reagents	251769	Undiluted