Метод электропорации для преобразования риккетсии spp. с флуоресцентным белково-экспрессирующим челночным вектором в клеточных линиях клещей
Summary
Электропорация — это быстрый, широко распространенный метод введения экзогенной ДНК в род Rickettsia. Данный протокол обеспечивает полезный метод электропорации для трансформации облигатных внутриклеточных бактерий рода Rickettsia.
Abstract
Риккетсиозы вызываются широким спектром облигатных внутриклеточных бактерий, принадлежащих к роду Rickettsia , которые могут передаваться позвоночным хозяевам через укус инфицированных членистоногих векторов. На сегодняшний день возникающие или вновь возникающие эпидемические риккетсиозы остаются риском для здоровья населения из-за трудностей в диагностике, поскольку методы диагностики ограничены и не стандартизированы или общедоступны. Ошибочный диагноз, возникающий в результате отсутствия распознавания признаков и симптомов, может привести к задержке лечения антибиотиками и плохим результатам для здоровья. Всестороннее понимание характеристик риккетсии в конечном итоге улучшит клиническую диагностику, оценку и лечение с улучшенным контролем и профилактикой заболевания.
Функциональные исследования риккетсиальных генов имеют решающее значение для понимания их роли в патогенезе. В данной работе описана процедура электропорации штамма Rickettsia parkeri Tate’s Hell с челночным вектором pRAM18dSFA и селекция трансформированного R. parkeri в культуре клеток клещей с антибиотиками (спектиномицин и стрептомицин). Также описан способ локализации трансформированного R. parkeri в клещевых клетках с использованием конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии, полезной методики проверки трансформации в векторных клеточных линиях. Подобные подходы подходят и для трансформации других риккетсий.
Introduction
Риккетсиозы вызываются широким спектром облигатных внутриклеточных бактерий, которые принадлежат к роду Rickettsia (семейство Rickettsiaceae, отряд Rickettsiales). Род Rickettsia классифицируется на четыре основные группы на основе филогенетических характеристик 1,2: группа пятнистой лихорадки (SFG), которая содержит те риккетсии, которые вызывают наиболее тяжелые и смертельные клещевые риккетсиозы (например, Rickettsia rickettsii, возбудитель пятнистой лихорадки Скалистых гор), группа тифа (TG, например, Rickettsia prowazekii, возбудитель эпидемического тифа), переходная группа (TRG, например, Rickettsia felis, возбудитель пятнистой лихорадки, переносимой блохами), и предковая группа (AG, например, Rickettsia bellii).
Среди старейших известных трансмиссивных заболеваний риккетсиозы в основном приобретаются после передачи патогенов через укусы инфицированных членистоногих переносчиков, включая клещей, блох, вшей и клещей 3,4. Хотя открытие эффективных антибиотиков улучшило результаты лечения, возникающие и вновь возникающие эпидемические риккетсиозы продолжают бросать вызов традиционным стратегиям профилактики и контроля. Таким образом, всестороннее понимание взаимодействия риккетсии/хозяина/вектора в конечном итоге создаст прочную основу для разработки новых подходов к профилактике и лечению этих древних заболеваний.
В природе горизонтальный перенос генов (HGT) у бактерий происходит путем конъюгации, трансдукции и трансформации5. Бактериальная трансформация in vitro использует эти концепции HGT, хотя внутриклеточная природа риккетсий представляет некоторые проблемы. Ограниченные условия роста и плохо изученные системы конъюгации и трансдукции у разных видов риккетсий препятствовали применению методов конъюгации и трансдукции у риккетсий 6,7,8. По сравнению с другими облигатными внутриклеточными бактериальными родами (например, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma и Ehrlichia), род Rickettsia отличается в отношении стратегий роста и репликации в цитоплазме клеток, что создает специфические проблемы для генетической модификации риккетсий из-за их уникальных особенностей образа жизни9.
Первоначальное препятствие, которое необходимо преодолеть при попытке генетической модификации риккетсий, заключается в достижении успешной трансформации. Таким образом, разработка осуществимого подхода с высокой эффективностью трансформации была бы чрезвычайно ценной для разработки генетических инструментов для риккетсий. Здесь мы сосредоточимся на электропорации, широко признанном методе трансформации, который был использован для успешного введения экзогенной ДНК в несколько видов риккетсий, включая Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii и Rickettsia buchneri 10,11,12 ,13,14,15,16.
В данной статье описывается процедура электропорации штамма R. parkeri Tate’s Hell (присоединение: GCA_000965145.1) с челночным вектором pRAM18dSFA, полученным из штамма Rickettsia amblyommatis AaR/SC плазмиды pRAM18, спроектированного для кодирования mKATE, дальнекрасого флуоресцентного белка, и aadA, придающего резистентность к спектиномицину и стрептомицину 13,15,20. Трансформированные R. parkeri жизнеспособны и стабильно поддерживаются при выделении антибиотиков в клеточных линиях клещей. Кроме того, показано, что локализация трансформированного R. parkeri в живых клетках клещей с помощью конфокальной микроскопии может быть использована для оценки качества скоростей трансформации в векторных клеточных линиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы демонстрируем метод введения экзогенной ДНК, закодированной на челночной плазмиде pRAM18dSFA, в риккетсии с использованием электропорации. В этой процедуре бесклеточные риккетсии были очищены от клеток-хозяев, преобразованы риккетсиальным челночным вектором и выпущены на клещев…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Тимоти Куртти и Бенджамина Калла за их проницательные дискуссии и предложения. Это исследование было финансово поддержано грантом U.G.M. от NIH (2R01AI049424) и грантом U.G.M. от Миннесотской сельскохозяйственной экспериментальной станции (MIN-17-078).
Materials
| 0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| 2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
| 5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
| 60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
| absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
| Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
| Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
| extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
| Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
| hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
| HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
| ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
| KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
| lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
| Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
| Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
| sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
| Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
Referências
- Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
- Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
- Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
- Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
- Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
- Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
- Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
- Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
- Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
- Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
- Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
- Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
- Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
- Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
- Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
- Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
- Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
- Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
- Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
- Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
- Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
- Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
- Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
- Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
- Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).
