O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.
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Artigo de método
Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apesar dos notáveis avanços na compreensão da biologia tumoral, a grande maioria dos candidatos a medicamentos oncológicos que entram em ensaios clínicos falham, muitas vezes devido à falta de eficácia clínica. Essa alta taxa de falha ilumina a incapacidade dos modelos pré-clínicos atuais em predizer a eficácia clínica, principalmente devido à sua inadequação em refletir a heterogeneidade tumoral e o microambiente tumoral. Essas limitações podem ser abordadas com modelos de cultura tridimensionais (3D) (esferoides) estabelecidos a partir de amostras tumorais humanas derivadas de pacientes individuais. Essas culturas 3D representam melhor a biologia do mundo real do que linhagens celulares estabelecidas que não refletem a heterogeneidade tumoral. Além disso, as culturas 3D são melhores do que os modelos de cultura 2D (estruturas monocamadas), pois replicam elementos do ambiente tumoral, como hipóxia, necrose e adesão celular, e preservam a forma e o crescimento natural da célula. No presente estudo, um método foi desenvolvido para preparar culturas primárias de células cancerosas de pacientes individuais que são 3D e crescem em esferoides multicelulares. As células podem ser derivadas diretamente de tumores de pacientes ou xenoenxertos derivados de pacientes. O método é amplamente aplicável a tumores sólidos (por exemplo, cólon, mama e pulmão) e também é custo-efetivo, pois pode ser realizado em sua totalidade em um laboratório típico de pesquisa de câncer/biologia celular sem depender de equipamentos especializados. Neste trabalho, é apresentado um protocolo para gerar modelos 3D de cultura tumoral (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primárias e avaliar sua sensibilidade a drogas usando duas abordagens complementares: um ensaio de viabilidade celular (MTT) e exames microscópicos. Esses esferoides multicelulares podem ser usados para avaliar potenciais candidatos a fármacos, identificar potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos e investigar os mecanismos de resposta e resistência.
Introdução
Estudos in vitro e in vivo representam abordagens complementares para o desenvolvimento de tratamentos oncológicos. Os modelos in vitro permitem o controle da maioria das variáveis experimentais e facilitam as análises quantitativas. Muitas vezes servem como plataformas de triagem de baixo custo e também podem ser usadas para estudos mecanísticos1. No entanto, sua relevância biológica é inerentemente limitada, uma vez que tais modelos refletem apenas parcialmente o microambientetumoral1. Em contraste, modelos in vivo, como os xenoenxertos derivados do paciente (PDX), capturam a complex....
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Protocolo
A coleta de amostras de tumores humanos utilizadas para as culturas de células tumorais primárias foi realizada de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional (IRB) no Rabin Medical Center, com consentimento informado por escrito dos pacientes. Os pacientes elegíveis para participação no estudo incluíram pacientes com câncer adulto e pediátrico, de ambos os sexos, com câncer de mama, cólon, fígado, pulmão, neuroendócrino, ovário ou pâncreas não metastático, qualquer câncer pediátrico ou qualquer câncer metastático. O único critério de exclusão foi a falta de capacidade para fornecer o consentimento informado.
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Resultados
Este protocolo apresenta procedimentos para gerar uma cultura homogênea de esferoides a partir de células tumorais primárias, avaliar quantitativamente a eficácia de drogas em cultura de esferoides (ensaio de MTT) e determinar o efeito de drogas em estudo sobre a morfologia esferoide. Dados representativos de experimentos em esferoides gerados a partir de culturas de células de câncer de cólon e mama são apresentados. Experimentos semelhantes foram realizados usando outros tipos de tumores, incluindo colangiocarcinoma, c.......
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Discussão
O presente protocolo descreve um método simples para gerar culturas de células primárias 3D (esferoides) derivadas de amostras tumorais humanas. Esses esferoides podem ser usados para várias análises, incluindo a avaliação de potenciais candidatos a fármacos e combinações de fármacos, a identificação de potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos e a investigação dos mecanismos de resposta e resistência. O protocolo utiliza células tumorais primárias derivadas diretamente de amostras de pacientes ou células tumorais d.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 5 Fluorouracil | TEVA Israel | lote 16c22NA | Fluorouracil, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Dissociação Celular |
| Cisplatina | TEVA Israel | 20B06LA | Abiplatina, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Matriz de membrana basal, tipo 3 |
| DMSO (dimetil sulfóxido) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometer Leitor ELISA | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Ácido clorídrico (HCl) | Sigma Aldrich | 320331 | para solução de parada |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA& | nbsp; Versão 1.52a | Software de código aberto ImageJ |
| Isopropanol | Gadot | P180008215 | para solução de parada |
| L-glutamina | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio Sigma | Aldrich | M5655-1G |
| Aminoácidos não essenciais | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclibe | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Sem Penicilina de Cálcio e Magnésio |
| – estreptomicina | Invitrogen | 2119399 | |
| Fenol livre RPMI 1640 | Biological industries, Israel | 01-103-1A | |
| Reservatório de pipetagem | Alexred | RED LTT012025 | |
| RPMI-1640 meio de cultura | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0,5% solução | Indústrias biológicas, Israel | 03-102-1B | |
| Placa de 96 poços de fixação ultrabaixa | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
Referências
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).
- Yoshida, G. J.
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Reimpressões e permissões
