JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

ב Silico זיהוי ואפיון של circRNAs במהלך אינטראקציות פונדקאי-פתוגן

Published: October 21, 2022
doi:
10.3791/64565
, , ,
1Institute of Biological Sciences, Faculty of Science,Universiti Malaya, 2Centre for Research in Biotechnology for Agriculture (CEBAR),Universiti Malaya

Summary

הפרוטוקול המוגש כאן מסביר את צנרת הסיליקו המלאה הדרושה לחיזוי ולאפיון פונקציונלי של CirRNAs מנתוני שעתוק ריצוף RNA החוקרים אינטראקציות מארח-פתוגן.

Abstract

רנ”א מעגלי (circRNAs) הוא סוג של רנ”א לא מקודד שנוצר באמצעות שחבור אחורי. מעגלי רנ”א אלה נחקרים בעיקר בשל תפקידם כרגולטורים של תהליכים ביולוגיים שונים. יש לציין כי ראיות חדשות מוכיחות כי CirRNA מארח יכול לבוא לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי (DE) בעת הדבקה בפתוגנים (למשל, שפעת ווירוסי קורונה), דבר המצביע על תפקיד של circRNA בוויסות תגובות החיסון המולד של המארח. עם זאת, חקירות על תפקידם של circRNAs במהלך זיהומים פתוגניים מוגבלות על ידי הידע והמיומנויות הדרושים לביצוע הניתוח הביואינפורמטי הדרוש לזיהוי DE circRNAs מנתוני ריצוף RNA (RNA-seq). חיזוי וזיהוי ביואינפורמטיקה של circRNA הוא חיוני לפני כל אימות, ומחקרים פונקציונליים המשתמשים בטכניקות מעבדה רטובות יקרות וגוזלות זמן. כדי לפתור בעיה זו, פרוטוקול שלב אחר שלב של חיזוי סיליקו ואפיון של circRNAs באמצעות נתוני RNA-seq מסופק בכתב יד זה. ניתן לחלק את הפרוטוקול לארבעה שלבים: 1) חיזוי וכימות של DE circRNA באמצעות צינור CIRIquant; 2) ביאור באמצעות circBase ואפיון של DE circRNAs; 3) חיזוי אינטראקציה CircRNA-miRNA דרך צינור Circr; 4) ניתוח העשרה פונקציונלית של גנים הוריים circRNA באמצעות אונטולוגיה גנטית (GO) ואנציקלופדיה קיוטו של גנים וגנומים (KEGG). צינור זה יהיה שימושי בהנעת מחקר עתידי במבחנה ו-in vivo כדי לפענח עוד יותר את התפקיד של circRNA באינטראקציות מארח-פתוגן.

Introduction

אינטראקציות מארח-פתוגן מייצגות יחסי גומלין מורכבים בין הפתוגנים לבין אורגניזמים מארחים, אשר מעוררים את התגובה החיסונית המולדת של המארחים שבסופו של דבר מביאה לסילוק פתוגנים פולשים 1,2. במהלך זיהומים פתוגניים, מספר רב של גנים חיסוניים המאכסן מווסתים כדי לעכב את השכפול והשחרור של פתוגנים. לדוגמה, גנים נפוצים המעוררים אינטרפרון (ISGs) המווסתים על זיהומים פתוגניים כוללים ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I ו- OASL 3,4. מלבד גנים מקודדי חלבונים, מחקרים דיווחו גם כי RNA שאינו מקודד כגון RNA ארוך שאינו מקודד (lncRNAs), microRNA (miRNAs) ו- RNA מעגלי (circRNAs) גם לשחק תפקיד והם מווסתים בו זמנית במהלך זיהומים פתוגניים 5,6,7. בניגוד לגנים מקודדי חלבונים המקודדים בעיקר חלבונים כמולקולות פונקציונליות, RNA לא מקודד (ncRNAs) ידוע כמתפקד כמווסת של גנים ברמת השעתוק ואחרי השעתוק. עם זאת, מחקרים הכוללים השתתפות של RNA לא מקודד, במיוחד circRNAs, בוויסות הגנים החיסוניים של המארחים אינם מדווחים היטב בהשוואה לגנים מקודדי החלבון.

CircRNAs מאופיינים באופן נרחב על ידי מבנה לולאה רציפה סגורה קוולנטית, אשר נוצר באמצעות תהליך שחבור לא קנוני שנקרא שחבור אחורי8. תהליך השחבור האחורי, בניגוד לתהליך השחבור של רנ”א ליניארי קוגנטי, כולל קשירה של אתר התורם במורד הזרם לאתר המקבל במעלה הזרם, ויוצר מבנה בצורת מעגל. נכון לעכשיו, הוצעו שלושה מנגנוני שחבור אחוריים שונים עבור הביוגנזה של circRNAs. אלה הם RNA binding protein (RBP) mediated circularization9,10, intron-pairing-driven circularization 11, and lariat-driven circularization12,13,14. בהתחשב בכך ש-circRNA מחוברים מקצה לקצה במבנה מעגלי, הם נוטים להיות עמידים באופן טבעי לעיכול אקסונוקלאז רגיל, ולכן נחשבים יציבים יותר מעמיתיהם הליניאריים15. מאפיין נפוץ נוסף המוצג על ידי circRNA כולל ביטוי ספציפי לסוג התא או הרקמה במארחים16.

כפי שמשתמע מהמבנה הייחודי שלהם ומהביטוי הספציפי שלהם לתא או לרקמה, התגלו כבעלי תפקידים ביולוגיים חשובים בתאים. נכון להיום, אחד התפקידים הבולטים של סירק-רנ”א הוא תפקידם כספוגי מיקרו-רנ”א (miRNA)17,18. תפקיד רגולטורי זה של circRNAs מתרחש באמצעות קשירה משלימה של נוקלאוטידים circRNA עם אזור הזרעים של miRNAs. אינטראקציה כזו של circRNA-miRNA מעכבת את תפקודי הבקרה הרגילים של miRNA על mRNA מטרה, ובכך מווסתת את ביטוי הגנים19,20. בנוסף, CirRNAs ידועים גם לווסת ביטוי גנים על ידי אינטראקציה עם חלבונים קושרי RNA (RBPs) ויצירת קומפלקסים RNA-חלבון21. למרות ש-circRNA מסווגים כ-RNA שאינו מקודד, יש גם ראיות לכך ש-circRNA יכול לשמש כתבניות לתרגום חלבונים22,23,24.

לאחרונה הודגם כי CirRNAs ממלאים תפקיד מרכזי בוויסות יחסי הגומלין בין המאכסן לפתוגן, במיוחד בין המארחים לנגיפים. באופן כללי, מניחים כי הרנ”א של הפונדקאי מסייע בוויסות התגובה החיסונית של הפונדקאי כדי לחסל את הפתוגנים הפולשים. דוגמה ל-circRNA שמקדם תגובות חיסוניות של המארח היא circRNA_0082633, שדווחה על ידי Guo et al.25. CirRNA זה משפר את איתות אינטרפרון מסוג I (IFN) בתוך תאי A549, אשר מסייע לדכא שכפול וירוס שפעת25. יתר על כן, Qu et al. דיווחו גם על CirRNA אינטרוני אנושי, הנקרא circRNA AIVR, המקדם חסינות על ידי ויסות הביטוי של חלבון קושר CREB (CREBBP), מתמר אותות של IFN-β26,27. עם זאת, קיימים גם סירק-רנ”א הידועים כמקדמים את הפתוגנזה של מחלה בעת זיהום. לדוגמה, Yu et al. דיווחו לאחרונה על התפקיד שממלא CirRNA שחבור מתחום אצבע אבץ GATA המכיל את הגן 2A (circGATAD2A) בקידום שכפול נגיף H1N1 באמצעות עיכוב של אוטופגיה של התא המארח28.

כדי לחקור ביעילות circRNAs, מיושם בדרך כלל אלגוריתם חיזוי circRNA כלל-גנומי, ואחריו אפיון בסיליקו של המועמדים החזויים ל-circRNA לפני שניתן לבצע מחקרים פונקציונליים כלשהם. גישה ביואינפורמטית כזו לחיזוי ואפיון CirRNA היא פחות יקרה ויותר חסכונית בזמן. זה עוזר לחדד את מספר המועמדים להיחקר באופן פונקציונלי ועשוי להוביל לממצאים חדשים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט מבוסס ביואינפורמטיקה לזיהוי, אפיון וביאור פונקציונלי של circRNA במהלך אינטראקציות פונדקאי-פתוגן. הפרוטוקול כולל זיהוי וכימות של circRNA ממערכי נתונים של ריצוף RNA, ביאור באמצעות circBase, ואפיון המועמדים ל-circRNA במונחים של סוגי circRNA, מספר גנים חופפים ואינטראקציות circRNA-miRNA חזויות. מחקר זה מספק גם את הביאור הפונקציונלי של הגנים ההוריים circRNA באמצעות אונטולוגיה גנטית (GO) ואנציקלופדיה קיוטו של גנים וגנומים (KEGG) ניתוח העשרה.

Protocol

בפרוטוקול זה, מערכי נתונים של ספריית RNA-seq ריבוזומלית (rRNA)-מדולדלת RNA-seq שהוכנו מתאי מקרופאג אנושיים נגועים בנגיף שפעת A הורדו ושימשו ממסד הנתונים של אומניבוס ביטוי גנים (GEO). כל צינור הביואינפורמטיקה מהחיזוי ועד לאפיון הפונקציונלי של ה-circRNA מסוכם באיור 1. כל חלק של הצינור מוסבר…

Representative Results

הפרוטוקול שגויס בסעיף הקודם שונה והוגדר כך שיתאים למערכת ההפעלה לינוקס. הסיבה העיקרית היא שרוב ספריות המודולים והחבילות המעורבות בניתוח circRNAs יכולות לעבוד רק על פלטפורמת לינוקס. בניתוח זה, מערכי נתונים של ספריית RNA-seq ריבוזומלית (rRNA)-מדולדלת RNA-seq שהוכנו מתאי המקרופאגים האנושיים הנגועים בנג…

Discussion

כדי להמחיש את התועלת של פרוטוקול זה, RNA-seq מתאי מקרופאג אנושיים נגועים בנגיף שפעת A שימש כדוגמה. נבדקו סירקרנ”א המתפקדים כספוגי miRNA פוטנציאליים באינטראקציות פונדקאי-פתוגן והעשרה תפקודית של GO ו-KEGG בתוך פונדקאי. למרות שיש מגוון רחב של כלי circRNA זמין באינטרנט, כל אחד מהם הוא חבילה עצמאית שאינה אי?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחבר רוצה להודות לטאן קה אן ולד”ר קמרון בראקן על ביקורתם על כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוכנית מענקי מחקר בסיסית (FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15) ומענק מחקר בעל השפעה גבוהה באוניברסיטת מלאיה (UM. ג/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).

Materials

Bedtools GitHub https://github.com/arq5x/bedtools2/ Referring to section 4.1.2. Needed for Circr.
BWA Burrows-Wheeler Aligner http://bio-bwa.sourceforge.net/ Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome
Circr GitHub https://github.com/bicciatolab/Circr Referring to section 4. Use to predict the miRNA binding sites
CIRIquant GitHub https://github.com/bioinfo-biols/CIRIquant Referring to section 2.1.3. To predict circRNAs
Clusterprofiler GitHub https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler Referring to section 7. For GO and KEGG functional enrichment
CPU Intel  Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz   Cores: 6-core CPU Memory: 65 GB Graphics card: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000)  Specifications used to run this entire protocol.
Cytoscape Cytoscape https://cytoscape.org/download.html Referring to section 5.2. Needed to plot ceRNA network
FastQC Babraham Bioinformatics https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ Referring to section 1.2.1. Quality checking on Fastq files
HISAT2 http://daehwankimlab.github.io/hisat2/ Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome
Linux Ubuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa) https://releases.ubuntu.com/focal/ Needed to run the entire protocol. Other Ubuntu versions may still be valid to carry out the protocol.
miRanda http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do Referring to section 4.1.2. Needed for Circr
Pybedtools pybedtools 0.8.2 https://pypi.org/project/pybedtools/ Needed for BED file genomic manipulation
Python Python 2.7 and 3.6 or abover https://www.python.org/downloads/ To run necessary library modules
R The Comprehensive R Archive Network https://cran.r-project.org/ To manipulate dataframes
RNAhybrid BiBiServ https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid Referring to section 4.1.2. Needed for Circr
RStudio RStudio https://www.rstudio.com/ A workspace to run R
samtools  SAMtools http://www.htslib.org/ Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant
StringTie Johns Hopkins University: Center for Computational Biology http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant
TargetScan GitHub https://github.com/nsoranzo/targetscan Referring to section 4.1.2. Needed for Circr
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Raman, K., Bhat, A. G., Chandra, N. A systems perspective of host-pathogen interactions: predicting disease outcome in tuberculosis. Molecular BioSystems. 6 (3), 516-530 (2010).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
  3. Yang, E., Li, M. M. H. All About the RNA: Interferon-stimulated genes that interfere with viral RNA processes. Frontiers in Immunology. 11, 605024 (2020).
  4. Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: A complex web of host defenses. Annual Review of Immunology. 32 (1), 513-545 (2014).
  5. Shirahama, S., Miki, A., Kaburaki, T., Akimitsu, N. Long non-coding RNAs involved in pathogenic infection. Frontiers in Genetics. 11, 454 (2020).
  6. Chandan, K., Gupta, M., Sarwat, M. Role of host and pathogen-derived microRNAs in immune regulation during infectious and inflammatory diseases. Frontiers in Immunology. 10, 3081 (2019).
  7. Chen, X., et al. Circular RNAs in immune responses and immune diseases. Theranostics. 9 (2), 588-607 (2019).
  8. Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
  9. Ashwal-Fluss, R., et al. circRNA biogenesis competes with pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 56 (1), 55-66 (2014).
  10. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  11. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  12. Robic, A., Demars, J., Kuhn, C. In-depth analysis reveals production of circular RNAs from non-coding sequences. Cells. 9 (8), 1806 (2020).
  13. Eger, N., Schoppe, L., Schuster, S., Laufs, U., Boeckel, J. N. Circular RNA splicing. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1087, 41-52 (2018).
  14. Barrett, S. P., Wang, P. L., Salzman, J. Circular RNA biogenesis can proceed through an exon-containing lariat precursor. eLife. 4, 07540 (2015).
  15. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  16. Misir, S., Wu, N., Yang, B. B. Specific expression and functions of circular RNAs. Cell Death and Differentiation. 29 (3), 481-491 (2022).
  17. Bai, S., et al. Construct a circRNA/miRNA/mRNA regulatory network to explore potential pathogenesis and therapy options of clear cell renal cell carcinoma. Scientific Reports. 10 (1), 13659 (2020).
  18. Sakshi, S., Jayasuriya, R., Ganesan, K., Xu, B., Ramkumar, K. M. Role of circRNA-miRNA-mRNA interaction network in diabetes and its associated complications. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 26, 1291-1302 (2021).
  19. Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
  20. Lu, M. Circular RNA: functions, applications, and prospects. ExRNA. 2 (1), 15 (2020).
  21. Liu, K. S., Pan, F., Mao, X. D., Liu, C., Chen, Y. J. Biological functions of circular RNAs and their roles in occurrence of reproduction and gynecological diseases. American Journal of Translational Research. 11 (1), 1-15 (2019).
  22. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  23. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  24. Weigelt, C. M., et al. An insulin-sensitive circular RNA that regulates lifespan in Drosophila. Molecular Cell. 79 (2), 268-279 (2020).
  25. Guo, Y., et al. Identification and characterization of circular RNAs in the A549 cells following Influenza A virus infection. Veterinary Microbiology. 267, 109390 (2022).
  26. Qu, Z., et al. A novel intronic circular RNA antagonizes influenza virus by absorbing a microRNA that degrades CREBBP and accelerating IFN-β production. mBio. 12 (4), 0101721 (2021).
  27. Kawarada, Y., et al. TGF-β induces p53/Smads complex formation in the PAI-1 promoter to activate transcription. Scientific Reports. 6 (1), 35483 (2016).
  28. Yu, T., et al. Circular RNA GATAD2A promotes H1N1 replication through inhibiting autophagy. Veterinary Microbiology. 231, 238-245 (2019).
  29. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010)
  30. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  31. Zhang, J., Chen, S., Yang, J., Zhao, F. Accurate quantification of circular RNAs identifies extensive circular isoform switching events. Nature Communications. 11 (1), 90 (2020).
  32. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  33. Kim, D., Paggi, J. M., Park, C., Bennett, C., Salzberg, S. L. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nature Biotechnology. 37 (8), 907-915 (2019).
  34. Pertea, M., et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nature Biotechnology. 33 (3), 290-295 (2015).
  35. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  36. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).
  37. Dori, M., Caroli, J., Forcato, M. Circr, a computational tool to identify miRNA:circRNA associations. Frontiers in Bioinformatics. 2, 852834 (2022).
  38. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  39. Wu, T., et al. clusterProfiler 4.0: A universal enrichment tool for interpreting omics data. The Innovation. 2 (3), 100141 (2021).
  40. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS: A Journal of Integrative Biology. 16 (5), 284-287 (2012).
  41. . org.Hs.eg.db: Genome wide annotation for human. 2022. R package version 3.15.0 Available from: https://bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/org.Hs.eg.db.html (2022)
  42. Barrett, T., et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets-update. Nucleic Acids Research. 41, 991-995 (2012).
  43. Gao, Y., Zhang, J., Zhao, F. Circular RNA identification based on multiple seed matching. Briefings in Bioinformatics. 19 (5), 803-810 (2018).
  44. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  45. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  46. Wang, K., et al. MapSplice: Accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), 178 (2010).
  47. Song, X., et al. Circular RNA profile in gliomas revealed by identification tool UROBORUS. Nucleic Acids Research. 44 (9), 87 (2016).
  48. Hansen, T. B. Improved circRNA identification by combining prediction algorithms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 20 (2018).
  49. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  50. Ma, X. K., et al. CIRCexplorer3: A CLEAR pipeline for direct comparison of circular and linear RNA expression. Genomics Proteomics Bioinformatics. 17 (5), 511-521 (2019).
  51. Gaffo, E., Buratin, A., Dal Molin, A., Bortoluzzi, S. Sensitive, reliable and robust circRNA detection from RNA-seq with CirComPara2. Briefings in Bioinformatics. 23 (1), (2022).
  52. Glažar, P., Papavasileiou, P., Rajewsky, N. circBase: a database for circular RNAs. RNA. 20 (11), 1666-1670 (2014).
  53. Tan, S., et al. Circular RNA F-circEA-2a derived from EML4-ALK fusion gene promotes cell migration and invasion in non-small cell lung cancer. Molecular Cancer. 17 (1), 138 (2018).
  54. Guarnerio, J., et al. Oncogenic role of Fusion-circRNAs Derived from cancer-associated chromosomal translocations. Cell. 165 (2), 289-302 (2016).
  55. McGeary, S. E., et al. The biochemical basis of microRNA targeting efficacy. Science. 366 (6472), (2019).
  56. Enright, A. J., et al. MicroRNA targets in Drosophila. Genome Biology. 5 (1), 1 (2003).
  57. Rehmsmeier, M., Steffen, P., Hochsmann, M., Giegerich, R. Fast and effective prediction of microRNA/target duplexes. RNA. 10 (10), 1507-1517 (2004).
  58. Zhang, D., et al. AllEnricher: a comprehensive gene set function enrichment tool for both model and non-model species. BMC Bioinformatics. 21 (1), 106 (2020).
  59. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523 (2019).

Tags

Keywords: CircRNAHost-pathogen InteractionsIn Silico IdentificationCharacterizationBioinformaticsRNA-seq AnalysisDifferential Expression AnalysisCiriquantPrepDE.pyCiri DE ReplicateLinuxProgrammingProtocolWorkflow
check_url/pt/64565?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Ealam Selvan, M., Lim, K. S., Teo, C. H., Lim, Y. In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (188), e64565, doi:10.3791/64565 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image