JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

In Silico Идентификация и характеристика цирковых РНК во время взаимодействий хозяина и патогена

Published: October 21, 2022
doi:
10.3791/64565
, , ,
1Institute of Biological Sciences, Faculty of Science,Universiti Malaya, 2Centre for Research in Biotechnology for Agriculture (CEBAR),Universiti Malaya

Summary

Представленный здесь протокол объясняет полный конвейер in silico , необходимый для прогнозирования и функциональной характеристики цирковых РНК на основе данных транскриптома секвенирования РНК, изучающих взаимодействия хозяина и патогена.

Abstract

Кольцевые РНК (цирковые РНК) представляют собой класс некодирующих РНК, которые образуются путем обратного сплайсинга. Эти циркулярные РНК преимущественно изучаются на предмет их роли в качестве регуляторов различных биологических процессов. Примечательно, что новые данные демонстрируют, что цирковые РНК хозяина могут дифференциально экспрессироваться (ДЭ) при инфицировании патогенами (например, гриппом и коронавирусами), что свидетельствует о роли циркРНК в регуляции врожденных иммунных реакций хозяина. Однако исследования роли цирковых РНК во время патогенных инфекций ограничены знаниями и навыками, необходимыми для проведения необходимого биоинформатического анализа для идентификации цирковых РНК DE по данным секвенирования РНК (RNA-seq). Биоинформационное прогнозирование и идентификация циркулярных РНК имеет решающее значение перед любой проверкой и функциональными исследованиями с использованием дорогостоящих и трудоемких методов мокрой лаборатории. Для решения этой проблемы в данной рукописи приведен пошаговый протокол in silico предсказания и характеристики цирковых РНК с использованием данных RNA-seq. Протокол можно разделить на четыре этапа: 1) Прогнозирование и количественное определение циркулярных РНК DE с помощью конвейера CIRIquant; 2) Аннотация через circBase и характеристика цирковых РНК DE; 3) Прогнозирование взаимодействия CircRNA-miRNA через конвейер Circr; 4) анализ функционального обогащения родительских генов циркРНК с использованием Gene Ontology (GO) и Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Этот конвейер будет полезен для проведения будущих исследований in vitro и in vivo для дальнейшего раскрытия роли цирковых РНК во взаимодействиях хозяина и патогена.

Introduction

Взаимодействия хозяина и патогена представляют собой сложное взаимодействие между патогенами и организмами-хозяевами, которое запускает врожденные иммунные реакции хозяев, которые в конечном итоге приводят к удалению вторгшихся патогенов 1,2. Во время патогенных инфекций регулируется множество иммунных генов хозяина, чтобы ингибировать репликацию и высвобождение патогенов. Например, общие интерферон-стимулированные гены (ISG), регулируемые патогенными инфекциями, включают ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I и OASL 3,4. Помимо генов, кодирующих белок, исследования также показали, что некодирующие РНК, такие как длинные некодирующие РНК (днРНК), микроРНК (миРНК) и кольцевые РНК (циркРНК), также играют роль и регулируются одновременно во время патогенных инфекций 5,6,7. В отличие от генов, кодирующих белки, которые в основном кодируют белки как функциональные молекулы, известно, что некодирующие РНК (нРНК) функционируют как регуляторы генов на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях. Однако исследования, включающие участие некодирующих РНК, особенно цирковых РНК, в регуляции иммунных генов хозяев, не очень хорошо представлены по сравнению с генами, кодирующими белок.

Цирковые РНК широко характеризуются своей ковалентно замкнутой непрерывной петлевой структурой, которая генерируется с помощью неканонического процесса сплайсинга, называемого обратным сплайсингом8. Процесс обратного сплайсинга, в отличие от процесса сплайсинга родственных линейных РНК, включает лигирование нижестоящего донорного сайта с вышестоящим акцепторным сайтом, образуя структуру круглой формы. В настоящее время предложены три различных механизма обратного сплайсинга для биогенеза циркРНК. Это опосредованная РНК связывающим белком (RBP)циркуляция 9,10, циркуляция, управляемая спариванием интронов, 11 и циркуляция, управляемая лариатом12,13,14. Учитывая, что цирковые РНК соединены встык в кольцевую структуру, они, как правило, естественным образом устойчивы к нормальному расщеплению экзонуклеазы и, таким образом, считаются более стабильными, чем их линейные аналоги15. Другая общая характеристика, проявляемая циркРНК, включает специфическую для клеток или тканей экспрессию у хозяев16.

Как следует из их уникальной структуры и клеточной или тканеспецифической экспрессии, было обнаружено, что циркРНК играют важные биологические функции в клетках. На сегодняшний день одной из основных функций цирковых РНК является их роль в качестве губок микроРНК (миРНК)17,18. Эта регуляторная роль цирковых РНК происходит за счет комплементарного связывания нуклеотидов циркРНК с затравочной областью микроРНК. Такое взаимодействие circRNA-miRNA ингибирует нормальные регуляторные функции микроРНК на мРНК-мишенях, тем самым регулируя экспрессию генов 19,20. Кроме того, известно также, что цирковые РНК регулируют экспрессию генов, взаимодействуя с РНК-связывающими белками (RBP) и образуя РНК-белковые комплексы21. Хотя цирковые РНК классифицируются как некодирующие РНК, есть также доказательства того, что цирковые РНК могут выступать в качестве шаблонов для трансляции белка22,23,24.

Недавно было продемонстрировано, что цирковые РНК играют ключевую роль в регулировании взаимодействий хозяина и патогена, особенно между хозяевами и вирусами. Как правило, предполагается, что циркРНК хозяина помогают регулировать иммунные реакции хозяина для устранения вторгшихся патогенов. Примером циркулярной РНК, способствующей иммунному ответу хозяина, является circRNA_0082633, о чем сообщают Guo et al.25. Эта циркулярная РНК усиливает передачу сигналов интерферона I типа (ИФН) в клетках A549, что помогает подавить репликацию вируса гриппа25. Кроме того, Qu et al. также сообщили об интронной циркулярной РНК человека, называемой циркулярной РНК AIVR, которая способствует иммунитету, регулируя экспрессию CREB-связывающего белка (CREBBP), сигнального преобразователя ИФН-β26,27. Тем не менее, циркулярные РНК, которые, как известно, способствуют патогенезу заболевания при заражении, также существуют. Например, Yu et al. недавно сообщили о роли, которую играет циркулярная РНК, сплайсированная из домена цинкового пальца GATA, содержащего ген 2A (circGATAD2A), в стимулировании репликации вируса H1N1 посредством ингибирования аутофагии клетки-хозяина28.

Для эффективного изучения цирковых РНК обычно реализуется полногеномный алгоритм прогнозирования циркулярных РНК с последующей характеристикой in silico предсказанных кандидатов на циркРНК до того, как можно будет провести какие-либо функциональные исследования. Такой биоинформатический подход к прогнозированию и характеристике цирковых РНК является менее дорогостоящим и более эффективным по времени. Это помогает уточнить количество кандидатов, подлежащих функциональному изучению, и потенциально может привести к новым выводам. Здесь мы предоставляем подробный биоинформатический протокол для идентификации, характеристики и функциональной аннотации circRNA in silico во время взаимодействия хозяина и патогена. Протокол включает идентификацию и количественное определение цирковых РНК из наборов данных секвенирования РНК, аннотацию через circBase и характеристику кандидатов на цирковые РНК с точки зрения типов цирковых РНК, количества перекрывающихся генов и прогнозируемых взаимодействий циркРНК-миРНК. Это исследование также обеспечивает функциональную аннотацию родительских генов циркРНК с помощью онтологии генов (GO) и анализа обогащения Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG).

Protocol

В этом протоколе из базы данных Gene Expression Omnibus (GEO) были загружены и использованы деидентифицированные наборы данных библиотеки РНК-секвенирования РНК (рРНК), подготовленные из инфицированных вирусом гриппа А клеток макрофагов человека. Весь конвейер биоинформатики от прогнозирования д…

Representative Results

Протокол, перечисленный в предыдущем разделе, был изменен и настроен в соответствии с системой ОС Linux. Основная причина заключается в том, что большинство библиотек модулей и пакетов, участвующих в анализе circRNA, могут работать только на платформе Linux. В этом анализе деидентифицированные …

Discussion

Чтобы проиллюстрировать полезность этого протокола, в качестве примера использовали РНК-секвенирование из инфицированных вирусом гриппа А клеток макрофагов человека. Были исследованы циркРНК, функционирующие как потенциальные губки микроРНК во взаимодействиях хозяин-патоген, и их ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Автор хотел бы поблагодарить Тан Ке Эн и доктора Кэмерона Брэкена за их критическую рецензию на эту рукопись. Эта работа была поддержана грантами Схемы грантов на фундаментальные исследования (FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15) и Исследовательского гранта Университета Малайи (UM. C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).

Materials

Bedtools GitHub https://github.com/arq5x/bedtools2/ Referring to section 4.1.2. Needed for Circr.
BWA Burrows-Wheeler Aligner http://bio-bwa.sourceforge.net/ Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome
Circr GitHub https://github.com/bicciatolab/Circr Referring to section 4. Use to predict the miRNA binding sites
CIRIquant GitHub https://github.com/bioinfo-biols/CIRIquant Referring to section 2.1.3. To predict circRNAs
Clusterprofiler GitHub https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler Referring to section 7. For GO and KEGG functional enrichment
CPU Intel  Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz   Cores: 6-core CPU Memory: 65 GB Graphics card: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000)  Specifications used to run this entire protocol.
Cytoscape Cytoscape https://cytoscape.org/download.html Referring to section 5.2. Needed to plot ceRNA network
FastQC Babraham Bioinformatics https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ Referring to section 1.2.1. Quality checking on Fastq files
HISAT2 http://daehwankimlab.github.io/hisat2/ Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome
Linux Ubuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa) https://releases.ubuntu.com/focal/ Needed to run the entire protocol. Other Ubuntu versions may still be valid to carry out the protocol.
miRanda http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do Referring to section 4.1.2. Needed for Circr
Pybedtools pybedtools 0.8.2 https://pypi.org/project/pybedtools/ Needed for BED file genomic manipulation
Python Python 2.7 and 3.6 or abover https://www.python.org/downloads/ To run necessary library modules
R The Comprehensive R Archive Network https://cran.r-project.org/ To manipulate dataframes
RNAhybrid BiBiServ https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid Referring to section 4.1.2. Needed for Circr
RStudio RStudio https://www.rstudio.com/ A workspace to run R
samtools  SAMtools http://www.htslib.org/ Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant
StringTie Johns Hopkins University: Center for Computational Biology http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant
TargetScan GitHub https://github.com/nsoranzo/targetscan Referring to section 4.1.2. Needed for Circr
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Raman, K., Bhat, A. G., Chandra, N. A systems perspective of host-pathogen interactions: predicting disease outcome in tuberculosis. Molecular BioSystems. 6 (3), 516-530 (2010).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
  3. Yang, E., Li, M. M. H. All About the RNA: Interferon-stimulated genes that interfere with viral RNA processes. Frontiers in Immunology. 11, 605024 (2020).
  4. Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: A complex web of host defenses. Annual Review of Immunology. 32 (1), 513-545 (2014).
  5. Shirahama, S., Miki, A., Kaburaki, T., Akimitsu, N. Long non-coding RNAs involved in pathogenic infection. Frontiers in Genetics. 11, 454 (2020).
  6. Chandan, K., Gupta, M., Sarwat, M. Role of host and pathogen-derived microRNAs in immune regulation during infectious and inflammatory diseases. Frontiers in Immunology. 10, 3081 (2019).
  7. Chen, X., et al. Circular RNAs in immune responses and immune diseases. Theranostics. 9 (2), 588-607 (2019).
  8. Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
  9. Ashwal-Fluss, R., et al. circRNA biogenesis competes with pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 56 (1), 55-66 (2014).
  10. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  11. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  12. Robic, A., Demars, J., Kuhn, C. In-depth analysis reveals production of circular RNAs from non-coding sequences. Cells. 9 (8), 1806 (2020).
  13. Eger, N., Schoppe, L., Schuster, S., Laufs, U., Boeckel, J. N. Circular RNA splicing. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1087, 41-52 (2018).
  14. Barrett, S. P., Wang, P. L., Salzman, J. Circular RNA biogenesis can proceed through an exon-containing lariat precursor. eLife. 4, 07540 (2015).
  15. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  16. Misir, S., Wu, N., Yang, B. B. Specific expression and functions of circular RNAs. Cell Death and Differentiation. 29 (3), 481-491 (2022).
  17. Bai, S., et al. Construct a circRNA/miRNA/mRNA regulatory network to explore potential pathogenesis and therapy options of clear cell renal cell carcinoma. Scientific Reports. 10 (1), 13659 (2020).
  18. Sakshi, S., Jayasuriya, R., Ganesan, K., Xu, B., Ramkumar, K. M. Role of circRNA-miRNA-mRNA interaction network in diabetes and its associated complications. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 26, 1291-1302 (2021).
  19. Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
  20. Lu, M. Circular RNA: functions, applications, and prospects. ExRNA. 2 (1), 15 (2020).
  21. Liu, K. S., Pan, F., Mao, X. D., Liu, C., Chen, Y. J. Biological functions of circular RNAs and their roles in occurrence of reproduction and gynecological diseases. American Journal of Translational Research. 11 (1), 1-15 (2019).
  22. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  23. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  24. Weigelt, C. M., et al. An insulin-sensitive circular RNA that regulates lifespan in Drosophila. Molecular Cell. 79 (2), 268-279 (2020).
  25. Guo, Y., et al. Identification and characterization of circular RNAs in the A549 cells following Influenza A virus infection. Veterinary Microbiology. 267, 109390 (2022).
  26. Qu, Z., et al. A novel intronic circular RNA antagonizes influenza virus by absorbing a microRNA that degrades CREBBP and accelerating IFN-β production. mBio. 12 (4), 0101721 (2021).
  27. Kawarada, Y., et al. TGF-β induces p53/Smads complex formation in the PAI-1 promoter to activate transcription. Scientific Reports. 6 (1), 35483 (2016).
  28. Yu, T., et al. Circular RNA GATAD2A promotes H1N1 replication through inhibiting autophagy. Veterinary Microbiology. 231, 238-245 (2019).
  29. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010)
  30. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  31. Zhang, J., Chen, S., Yang, J., Zhao, F. Accurate quantification of circular RNAs identifies extensive circular isoform switching events. Nature Communications. 11 (1), 90 (2020).
  32. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  33. Kim, D., Paggi, J. M., Park, C., Bennett, C., Salzberg, S. L. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nature Biotechnology. 37 (8), 907-915 (2019).
  34. Pertea, M., et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nature Biotechnology. 33 (3), 290-295 (2015).
  35. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  36. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).
  37. Dori, M., Caroli, J., Forcato, M. Circr, a computational tool to identify miRNA:circRNA associations. Frontiers in Bioinformatics. 2, 852834 (2022).
  38. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  39. Wu, T., et al. clusterProfiler 4.0: A universal enrichment tool for interpreting omics data. The Innovation. 2 (3), 100141 (2021).
  40. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS: A Journal of Integrative Biology. 16 (5), 284-287 (2012).
  41. . org.Hs.eg.db: Genome wide annotation for human. 2022. R package version 3.15.0 Available from: https://bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/org.Hs.eg.db.html (2022)
  42. Barrett, T., et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets-update. Nucleic Acids Research. 41, 991-995 (2012).
  43. Gao, Y., Zhang, J., Zhao, F. Circular RNA identification based on multiple seed matching. Briefings in Bioinformatics. 19 (5), 803-810 (2018).
  44. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  45. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  46. Wang, K., et al. MapSplice: Accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), 178 (2010).
  47. Song, X., et al. Circular RNA profile in gliomas revealed by identification tool UROBORUS. Nucleic Acids Research. 44 (9), 87 (2016).
  48. Hansen, T. B. Improved circRNA identification by combining prediction algorithms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 20 (2018).
  49. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  50. Ma, X. K., et al. CIRCexplorer3: A CLEAR pipeline for direct comparison of circular and linear RNA expression. Genomics Proteomics Bioinformatics. 17 (5), 511-521 (2019).
  51. Gaffo, E., Buratin, A., Dal Molin, A., Bortoluzzi, S. Sensitive, reliable and robust circRNA detection from RNA-seq with CirComPara2. Briefings in Bioinformatics. 23 (1), (2022).
  52. Glažar, P., Papavasileiou, P., Rajewsky, N. circBase: a database for circular RNAs. RNA. 20 (11), 1666-1670 (2014).
  53. Tan, S., et al. Circular RNA F-circEA-2a derived from EML4-ALK fusion gene promotes cell migration and invasion in non-small cell lung cancer. Molecular Cancer. 17 (1), 138 (2018).
  54. Guarnerio, J., et al. Oncogenic role of Fusion-circRNAs Derived from cancer-associated chromosomal translocations. Cell. 165 (2), 289-302 (2016).
  55. McGeary, S. E., et al. The biochemical basis of microRNA targeting efficacy. Science. 366 (6472), (2019).
  56. Enright, A. J., et al. MicroRNA targets in Drosophila. Genome Biology. 5 (1), 1 (2003).
  57. Rehmsmeier, M., Steffen, P., Hochsmann, M., Giegerich, R. Fast and effective prediction of microRNA/target duplexes. RNA. 10 (10), 1507-1517 (2004).
  58. Zhang, D., et al. AllEnricher: a comprehensive gene set function enrichment tool for both model and non-model species. BMC Bioinformatics. 21 (1), 106 (2020).
  59. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523 (2019).

Tags

Keywords: CircRNAHost-pathogen InteractionsIn Silico IdentificationCharacterizationBioinformaticsRNA-seq AnalysisDifferential Expression AnalysisCiriquantPrepDE.pyCiri DE ReplicateLinuxProgrammingProtocolWorkflow
check_url/pt/64565?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Ealam Selvan, M., Lim, K. S., Teo, C. H., Lim, Y. In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions. J. Vis. Exp. (188), e64565, doi:10.3791/64565 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image