Burada sunulan protokol, konakçı-patojen etkileşimlerini inceleyen RNA dizileme transkriptom verilerinden sirkRNA’ları tahmin etmek ve işlevsel olarak karakterize etmek için gereken in silico boru hattının tamamını açıklamaktadır.
Dairesel RNA’lar (sirkRNA’lar), geri ekleme yoluyla oluşturulan kodlamayan RNA’ların bir sınıfıdır. Bu sirkRNA’lar ağırlıklı olarak çeşitli biyolojik süreçlerin düzenleyicileri olarak rolleri için incelenmiştir. Özellikle, ortaya çıkan kanıtlar, konakçı sirkRNA’ların patojenlerle (örneğin, influenza ve koronavirüsler) enfeksiyon üzerine farklı şekilde eksprese edilebileceğini (DE) göstermektedir, bu da sirkRNA’ların konakçı doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini düzenlemede bir rol oynadığını düşündürmektedir. Bununla birlikte, patojenik enfeksiyonlar sırasında sirkRNA’ların rolü üzerine yapılan araştırmalar, RNA dizileme (RNA-seq) verilerinden DE sirkRNA’larını tanımlamak için gerekli biyoinformatik analizi yapmak için gerekli bilgi ve becerilerle sınırlıdır. Biyoinformatik tahmin ve sirkRNA’ların tanımlanması, herhangi bir doğrulamadan önce ve maliyetli ve zaman alıcı ıslak laboratuvar tekniklerini kullanan fonksiyonel çalışmalardan önce çok önemlidir. Bu sorunu çözmek için, RNA-seq verilerini kullanarak sirkRNA’ların in silico tahmini ve karakterizasyonunun adım adım bir protokolü verilmiştir. Protokol dört adıma ayrılabilir: 1) CIRIquant boru hattı aracılığıyla DE sirkRNA’larının tahmini ve nicelleştirilmesi; 2) circBase yoluyla ek açıklama ve DE sirkRNA’larının karakterizasyonu; 3) Circr boru hattı üzerinden CircRNA-miRNA etkileşim tahmini; 4) Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) kullanılarak sirkRNA ebeveyn genlerinin fonksiyonel zenginleştirme analizi. Bu boru hattı, sirkRNA’ların konakçı-patojen etkileşimlerindeki rolünü daha da çözmek için gelecekteki in vitro ve in vivo araştırmaları yönlendirmede yararlı olacaktır.
Konakçı-patojen etkileşimleri, patojenler ve konakçı organizmalar arasındaki karmaşık bir etkileşimi temsil eder, bu da konakçıların doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini tetikler ve sonuçta istilacı patojenlerin uzaklaştırılmasıyla sonuçlanır 1,2. Patojenik enfeksiyonlar sırasında, konakçı immün genlerinin çoğu, patojenlerin replikasyonunu ve salınımını inhibe etmek için düzenlenir. Örneğin, patojenik enfeksiyonlar üzerinde düzenlenen yaygın interferon ile uyarılmış genler (ISG’ler) ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I ve OASL 3,4’ü içerir. Protein kodlayan genlerin yanı sıra, çalışmalar ayrıca uzun kodlamayan RNA’lar (lncRNA’lar), mikroRNA’lar (miRNA’lar) ve dairesel RNA’lar (sirkRNA’lar) gibi kodlamayan RNA’ların da rol oynadığını ve patojenik enfeksiyonlar sırasında eşzamanlı olarak düzenlendiğini bildirmiştir 5,6,7. Proteinleri esas olarak fonksiyonel moleküller olarak kodlayan protein kodlayan genlerin aksine, kodlamayan RNA’ların (ncRNA’lar) transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası seviyelerde genlerin düzenleyicileri olarak işlev gördüğü bilinmektedir. Bununla birlikte, kodlamayan RNA’ların, özellikle sirkRNA’ların, konakçıların bağışıklık genlerini düzenlemeye katılımını içeren çalışmalar, protein kodlayan genlere kıyasla iyi rapor edilmemiştir.
SirkRNA’lar, geri ekleme8 adı verilen kanonik olmayan bir ekleme işlemi ile üretilen kovalent kapalı sürekli döngü yapıları ile yaygın olarak karakterize edilir. Geri ekleme işlemi, konyak lineer RNA’ların ekleme işleminden farklı olarak, aşağı akış donör bölgesinin yukarı akış alıcı bölgesine bağlanmasını ve dairesel şekilli bir yapı oluşturmasını içerir. Şu anda, sirkRNA’ların biyogenezi için üç farklı geri ekleme mekanizması önerilmiştir. Bunlar RNA bağlayıcı protein (RBP) aracılı daireselleştirme 9,10, intron eşleştirme güdümlü daireselleştirme 11 ve lariat güdümlü daireselleştirme12,13,14’tür. SirkRNA’ların dairesel bir yapıda uçtan uca bağlandığı göz önüne alındığında, normal ekzonükleaz sindirimlerine karşı doğal olarak dirençli olma eğilimindedirler ve bu nedenle doğrusal muadillerinden daha kararlı oldukları düşünülmektedir15. SirkRNA’lar tarafından sergilenen bir diğer ortak özellik, konakçılardaki hücre veya doku tipine özgü ekspresyonu içerir16.
Benzersiz yapıları ve hücre veya dokuya özgü ekspresyonları ile ima edildiği gibi, sirkRNA’ların hücrelerde önemli biyolojik işlevler oynadığı keşfedilmiştir. Bugüne kadar, sirkRNA’ların öne çıkan işlevlerinden biri, mikroRNA (miRNA) süngerleri olarak rolleridir17,18. SirkRNA’ların bu düzenleyici rolü, sirkRNA nükleotidlerinin miRNA’ların tohum bölgesi ile tamamlayıcı bağlanmasıyla gerçekleşir. Böyle bir sirkRNA-miRNA etkileşimi, miRNA’ların hedef mRNA’lar üzerindeki normal düzenleyici fonksiyonlarını inhibe eder, böylece19,20 genlerinin ekspresyonunu düzenler. Ek olarak, sirkRNA’ların, RNA bağlayıcı proteinlerle (RBP’ler) etkileşime girerek ve RNA-protein kompleksleri21’i oluşturarak gen ekspresyonunu düzenlediği de bilinmektedir. Her ne kadar sirkRNA’lar kodlamayan RNA’lar olarak sınıflandırılsa da, sirkRNA’ların protein translasyonu için şablon görevi görebileceğine dair kanıtlar da vardır22,23,24.
Son zamanlarda, sirkRNA’ların, özellikle konakçılar ve virüsler arasında, konakçı-patojen etkileşimlerinin düzenlenmesinde önemli roller oynadığı gösterilmiştir. Genel olarak, konakçı sirkRNA’ların, istilacı patojenleri ortadan kaldırmak için konağın bağışıklık tepkilerini düzenlemeye yardımcı olduğu varsayılır. Konakçı bağışıklık tepkilerini destekleyen bir sirkRNA örneği, Guo ve ark.25 tarafından bildirilen circRNA_0082633’dir. Bu sirkRNA, A549 hücreleri içindeki tip I interferon (IFN) sinyallemesini arttırır ve bu da influenza virüsü replikasyonunu baskılamaya yardımcı olur25. Dahası, Qu ve ark. ayrıca, IFN-β 26,27’nin bir sinyal dönüştürücüsü olan CREB-bağlayıcı proteinin (CREBBP) ekspresyonunu düzenleyerek bağışıklığı teşvik eden sirkRNA AIVR adı verilen bir insan intronik sirkRNA’sını da bildirmiştir. Bununla birlikte, enfeksiyon üzerine hastalığın patogenezini desteklediği bilinen sirkRNA’lar da mevcuttur. Örneğin, Yu ve ark. yakın zamanda, konakçı hücre otofajisi28’in inhibisyonu yoluyla H1N1 virüs replikasyonunu teşvik etmede 2A genini (circGATAD2A) içeren GATA çinko parmak alanından eklenmiş bir sirkRNA’nın oynadığı rolü bildirmiştir.
SirkRNA’ları etkili bir şekilde incelemek için, genellikle genom çapında bir sirkRNA tahmin algoritması uygulanır, ardından herhangi bir fonksiyonel çalışma yapılmadan önce tahmin edilen sirkRNA adaylarının in silico karakterizasyonu yapılır. SirkRNA’ları tahmin etmek ve karakterize etmek için böyle bir biyoinformatik yaklaşım daha az maliyetli ve daha fazla zaman verimlidir. İşlevsel olarak incelenecek aday sayısını iyileştirmeye yardımcı olur ve potansiyel olarak yeni bulgulara yol açabilir. Burada, konakçı-patojen etkileşimleri sırasında sirkRNA’ların in silico tanımlaması, karakterizasyonu ve fonksiyonel ek açıklaması için ayrıntılı bir biyoinformatik tabanlı protokol sunuyoruz. Protokol, RNA dizileme veri kümelerinden sirkRNA’ların tanımlanması ve nicelleştirilmesini, circBase aracılığıyla ek açıklama yapılmasını ve sirkRNA adaylarının sirkRNA tipleri, örtüşen genlerin sayısı ve öngörülen sirkRNA-miRNA etkileşimleri açısından karakterizasyonunu içerir. Bu çalışma aynı zamanda Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizi yoluyla sirkRNA ebeveyn genlerinin fonksiyonel ek açıklamasını sağlar.
Bu protokolün faydasını göstermek için, influenza A virüsü ile enfekte olmuş insan makrofaj hücrelerinden RNA-seq örnek olarak kullanılmıştır. Konakçı-patojen etkileşimlerinde potansiyel miRNA süngerleri olarak işlev gören sirkRNA’lar ve bir konakçı içinde GO ve KEGG fonksiyonel zenginleştirmeleri araştırıldı. Çevrimiçi olarak çeşitli sirkRNA araçları olmasına rağmen, her biri birbiriyle etkileşime girmeyen bağımsız bir pakettir. Burada, sirkRNA tahmini ve nicelleştirmesi, sirkRNA…
The authors have nothing to disclose.
Yazar, bu makaleyi eleştirel bir şekilde gözden geçirdikleri için Tan Ke En ve Dr. Cameron Bracken’e teşekkür eder. Bu çalışma, Temel Araştırma Hibe Programı (FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15) ve Malaya Üniversitesi Yüksek Etkili Araştırma Bursu (UM. C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).
Bedtools | GitHub | https://github.com/arq5x/bedtools2/ | Referring to section 4.1.2. Needed for Circr. |
BWA | Burrows-Wheeler Aligner | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome |
Circr | GitHub | https://github.com/bicciatolab/Circr | Referring to section 4. Use to predict the miRNA binding sites |
CIRIquant | GitHub | https://github.com/bioinfo-biols/CIRIquant | Referring to section 2.1.3. To predict circRNAs |
Clusterprofiler | GitHub | https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler | Referring to section 7. For GO and KEGG functional enrichment |
CPU | Intel | Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz Cores: 6-core CPU Memory: 65 GB Graphics card: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000) | Specifications used to run this entire protocol. |
Cytoscape | Cytoscape | https://cytoscape.org/download.html | Referring to section 5.2. Needed to plot ceRNA network |
FastQC | Babraham Bioinformatics | https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | Referring to section 1.2.1. Quality checking on Fastq files |
HISAT2 | http://daehwankimlab.github.io/hisat2/ | Referring to section 2.1.1 and 2.1.2. Needed to run CIRIquant, and to index the genome | |
Linux | Ubuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa) | https://releases.ubuntu.com/focal/ | Needed to run the entire protocol. Other Ubuntu versions may still be valid to carry out the protocol. |
miRanda | http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do | Referring to section 4.1.2. Needed for Circr | |
Pybedtools | pybedtools 0.8.2 | https://pypi.org/project/pybedtools/ | Needed for BED file genomic manipulation |
Python | Python 2.7 and 3.6 or abover | https://www.python.org/downloads/ | To run necessary library modules |
R | The Comprehensive R Archive Network | https://cran.r-project.org/ | To manipulate dataframes |
RNAhybrid | BiBiServ | https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid | Referring to section 4.1.2. Needed for Circr |
RStudio | RStudio | https://www.rstudio.com/ | A workspace to run R |
samtools | SAMtools | http://www.htslib.org/ | Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant |
StringTie | Johns Hopkins University: Center for Computational Biology | http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml | Referring to section 2.1.2. Needed to run CIRIquant |
TargetScan | GitHub | https://github.com/nsoranzo/targetscan | Referring to section 4.1.2. Needed for Circr |