인간 망막 색소 상피 세포(H-RPE)의 대사 상태는 건강과 기능을 반영합니다. 여기에 제시된 것은 고해상도 호흡 측정을 사용하여 H-RPE의 실시간 대사 플럭스를 검사하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.
망막 색소 상피 세포(RPE)의 대사 기능 장애는 노화 관련 황반변성(AMD) 및 증식성 유리체 망막병증(PVR)과 같은 망막 질환의 주요 병원성 동인입니다. RPE는 대사 활동이 활발한 세포이기 때문에 대사 상태의 변화는 건강과 기능의 변화를 반영합니다. 고분해능 호흡 측정법은 각각 세포외 산성화율(ECAR) 및 산소 소비율(OCR)의 정량화를 통해 두 가지 주요 생체 에너지 경로인 해당과정과 미토콘드리아 산화 인산화(OXPHOS)의 실시간 동역학 분석을 가능하게 합니다. 다음은 원발성 인간 망막 색소 상피 세포(H-RPE)에서 고해상도 호흡 측정을 수행하기 위해 최적화된 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 기본 및 최대 OXPHOS 및 당분해 능력을 정의하기 위해 RPE의 생체 에너지 프로파일을 생성하는 데 관련된 단계에 대한 자세한 설명을 제공합니다. H-RPE를 미토콘드리아 및 당분해 기계를 표적으로 하는 다양한 약물 주사에 노출시키면 주요 대사 매개변수를 계산할 수 있는 정의된 생체 에너지 프로파일이 생성됩니다. 이 프로토콜은 RPE에서 최대 호흡 용량을 유도하기 위해 카르보닐 시안화물 p-트리플루오로메톡시페닐히드라존(FCCP)에 비해 분리제로서 BAM15의 향상된 반응을 강조합니다. 이 프로토콜은 다양한 질병 조건에서 RPE의 생체 에너지 상태를 연구하고 RPE의 기초 대사 상태를 복원하는 신약의 효능을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.
망막 색소 상피 세포(RPE)는 융모막 모세혈관의 광수용체와 천공 내피 사이에 전략적으로 위치한 색소 상피 세포의 단층으로 존재합니다. RPE는 (1) 흘린 광수용체 디스크의 식균 작용, (2) 시각 주기를 유지하기 위한 시각 색소의 재활용, (3) 영양소, 대사 산물, 이온 및 물의 수송, (4) 빛의 흡수, (5) 광산화에 대한 보호, (6) 망막 무결성을 지원하는 필수 인자의 분비, (7) 외부 혈액-망막 장벽형성 1 . RPE의 변성은 대사 기능 장애 및 미토콘드리아 결함과 관련이 있어 연령 관련 황반변성(AMD) 및 증식성 유리체 망막병증(PVR)과 같은 실명성 안구 질환을 유발합니다.2.
두 가지 주요 생체 에너지 경로에는 세포질에서 발생하는 해당과정과 미토콘드리아에서 발생하는 산화적 인산화(OXPHOS)가 있습니다. 해당 과정 동안 포도당 한 분자는 피루브산 분자 2 분자로 전환되고 아데노신 삼인산 (ATP) 분자 2 분자의 순 생산이 이루어집니다. 해당과정과 달리 OXPHOS는 훨씬 더 높은 수준의 ATP(포도당 분자당 ~32-38개의 ATP 분자)를 생성합니다. 특히, OXPHOS는 산소를 소비하고 기능적 미토콘드리아가 일어나야 하는 반면, 해당과정은 세포질에서 발생하며 산소가 필요하지 않습니다.
미토콘드리아 호흡을 검사하기 위한 형광 또는 인광 기반 기술이 도입되기 전에 Clark형 산소 전극3이 장착된 챔버의 투과된 세포 현탁액에서 산소 수준을 측정했습니다. Clark 전극은 형광 기반 호흡 측정법보다 훨씬 저렴하고 비부착성 세포에서 작동하지만, 각 호흡 시간이 약 15-20분 동안 지속되고 각 샘플에 대해 훨씬 더 많은 양의 세포가 필요하기 때문에 상대적으로 처리량이 낮습니다3. 따라서 형광 기반 호흡 측정 기술은 Clark 전극을 크게 대체했으며 대사 및 미토콘드리아 연구 분야에서 널리 사용되는 기술이 되었습니다.
이 프로토콜은 살아있는 세포의 OXPHOS 및 당분해 생물 에너지 프로파일을 동역학적으로 측정하는 고처리량, 고분해능, 형광 기반 호흡 측정 기술을 설명합니다. OXPHOS의 공정은 산소를 소비하기 때문에, OXPHOS에 대한 생체 에너지 프로파일은 시간 경과에 따른 산소 소비율(OCR)의 변화를 매핑하여 생성된다4. 이 기술에서는 빛을 방출하는 광섬유 번들에 연결된 센서 카트리지 슬리브에 두 개의 형광단이 내장되어 형광단을 여기시킵니다. 형광단 방출의 변화는 고감도 형광 센서에 의해 측정되고 광섬유 다발을 통해 전송되어 OCR 판독값으로 변환됩니다(5). 형광단은 산소에 의해 소멸되어 산소 플럭스 또는 OCR로 알려진 분석 배지에서 세포외 산소 수준을 측정할 수 있습니다. 다른 형광단은 양성자 유출의 변화에 민감한 pH 센서 프로브로, 세포외 산성화율(ECAR) 측정으로 변환됩니다. 측정하는 동안 형광단이 내장된 광섬유 다발은 세포 단층 위 200μm로 낮아져 빠른 실시간 판독을 가능하게 하는 일시적인 마이크로 챔버를 생성합니다. 산소 또는 양성자 수준의 10% 변화가 감지되면 센서가 위로 들어 올려져 더 많은 양의 매체가 일시적인 마이크로 챔버 매체와 혼합되어 OCR 및 ECAR 값을 기준선으로 복원합니다. 각 센서 카트리지에는 분석 중에 웰당 최대 4개의 화합물을 순차적으로 투여할 수 있도록 4개의 포트가 장착되어 있습니다. 각 포트에 화합물을 주입하기 전과 후에 측정값을 수집하여 세포의 대사 상태에 대한 주요 정보를 확인할 수 있습니다.
이 두 가지 뚜렷한 대사 경로를 조사하면 서로 다른 병원성 자극에 노출된 후 RPE의 대사 상태에 관한 중요한 발견을 얻을 수 있으므로 RPE 6,7,8의 대사 무결성을 회복하는 약물의 효능을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 고처리량 호흡 측정법의 출현과 특정 미토콘드리아 억제제의 가용성은 RPE의 생체 에너지 프로파일을 정의하고 질병 상태동안 대사 및 미토콘드리아의 결함을 식별하는 데 더 많은 연구를 자극했습니다 6,7,8,9,10,11,12,13 . 고해상도 호흡 측정법은 AMD 및 PVR과 같은 망막 병리에서 RPE의 대사 재프로그래밍의 핵심 역할을 강조했습니다. AMD 및 PVR의 발병기전에 관여하는 두 가지 주요 사이토카인은 형질전환 성장 인자-베타 2(TGFβ2) 및 종양 괴사 인자-알파(TNFα)입니다. TGFβ2에 의한 상피-중간엽 전이(EMT)의 유도는 미토콘드리아 기능 장애, OXPHOS 억제 및 RPE6에서 당분해 능력의 보상적 증가를 동반합니다. 보다 최근에, 전염증성 사이토카인인 TNFα는 H-RPE7에서 기저 OXPHOS의 상당한 상향 조절 및 감소된 해당과정을 유도하는 것으로 나타났습니다. 디메틸 푸마레이트의 투여는 H-RPE에서 TNFα 유발 염증을 유의하게 억제하고 미토콘드리아 형태 및 기초 생체 에너지 프로파일을 회복시켰다7. 이 두 가지 성장 인자에 의해 유도된 다양한 대사 프로필은 망막 질환에서 대사 재프로그래밍의 관여에 관한 흥미로운 기계론적 질문을 자극합니다. 다음 프로토콜은 고해상도 호흡 측정을 사용하여 H-RPE에서 OXPHOS 및 해당 생물 에너지 프로파일을 평가하는 단계를 설명합니다.
H-RPE의 고분해능 호흡 측정에 최적화된 이 프로토콜은 일반적으로 사용되는 FCCP 대신 BAM15를 언커플러로 사용하는 것을 포함합니다. RPE의 고해상도 호흡 측정에 대한 이전 연구에서는 FCCP 9,24를 활용했지만 BAM15는 FCCP에 비해 H-RPE에서 최대 호흡 수준의 보다 강력한 유도를 유도하는 것으로 보입니다. FCCP와 BAM15는 모두 세포에서 사용하기에 안전하지만 BAM15는 FCCP 또는 CCCP(carbonylcyanide-3-chlorophenylhydrazone)25에 비해 정상 세포에서 부작용이 적은 것으로 보고되었습니다. Kenwood et al. BAM15는 원형질막 전위에 영향을 주지 않고 미토콘드리아를 탈분극하여 낮은 세포독성에서 지속적인 최대 미토콘드리아 호흡률을 유도한다는것을 보여주었습니다 26. 반면에 FCCP는 미토콘드리아와 원형질막을 모두 탈분극시키고 더 높은 세포 독성을 나타냅니다26.
프로토콜에는 마이크로플레이트의 모든 실험 웰에서 RPE의 합류하고 균일하며 균질한 단층에 세포가 적절하게 도금되도록 하는 것을 포함하여 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 성숙한 RPE는 에너지 생성을 위해 OXPHOS에 크게 의존하므로 RPE가 분석 중에 적절한 기저 및 최대 OCR 판독값을 생성하도록 세포가 최소 1개월 동안 성숙되도록 해야 합니다. CO2가 분석 배지의 pH에 영향을 줄 수 있으므로 기기에 넣기 전에 가습 오븐(CO2 없음)에서 37°C에서 1시간 동안 세포 배양 플레이트를 탈기하는 것은 정확한 ECAR 판독을 위해 매우 중요합니다. 분석 당일 신뢰할 수 있는 OCR 및 ECAR 판독값을 제공하기 위해 분석 전날 센서 카트리지에 수분을 공급하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 동결/해동 주기를 최소화하기 위해 주입할 약물을 적절하게 재구성하고 재구성된 약물 재고를 장기 보관을 위해 더 작은 부피로 분취하도록 주의해야 합니다. 분석 배지로 채워진 각 웰에 약물을 주입하여 희석을 고려하기 위해 각 분석 배지(예: Mito 스트레스 테스트용 Mito 스트레스 테스트 분석 배지에서 희석)에 희석된 10x 약물 용액을 준비하는 것이 중요합니다. 각각의 후속 약물 주입에는 각 웰에 더 많은 배지가 있으므로 로딩되는 약물의 양은 각 주사마다 증가하며 프로토콜에 지정된 부피를 따르도록 주의해야 합니다. 실험 완료 시 센서 카트리지를 검사하여 잔류 약물이 없는지 확인하고 현미경으로 세포 배양 플레이트를 관찰하여 융합성 및 균질한 세포 단층이 남아 있는지 확인하여 품질 검사를 수행하는 것이 중요합니다.
이 프로토콜의 수정에는 포트에 다른 약물을 주입하고 이러한 약물이 OCR 및 ECAR 판독값에 미치는 영향을 결정하는 것이 포함됩니다. 한 가지 인기 있는 수정 방법은 일반적인 Mito 또는 Glycolytic Stress Test 약물을 주입하기 전에 Port A로 선택한 실험 약물을 주입하는 것입니다. 이러한 유형의 프로토콜은 선택한 약물의 급성 주사가 후속 OXPHOS 및 당분해 매개변수에 어떤 영향을 미치는지에 대한 통찰력을 제공합니다. 다른 변형에는 다른 세포 유형을 검사하는 것이 포함됩니다. 이를 위해서는 OCR의 경우 50-100pmol/min, ECAR의 경우 10-20mpH/min 범위의 기본 판독값을 보장하여 최적의 파종 세포 밀도에 대한 초기 문제 해결과 분석 배지의 최적화가 필요합니다. 주입된 약물의 최적 농도는 약물의 연속 희석에 대한 OCR 및 ECAR 반응을 관찰하여 검사된 각각의 새로운 세포 유형에 대해 결정되어야 합니다.
프로토콜의 주요 한계는 세포가 정상적인 성장 배지에서CO2 인큐베이터에 있지 않기 때문에 시간이 지남에 따라 세포 생존율이 감소하므로 최대 세포 생존율을 보장하기 위해 3-4시간 이내에 분석을 완료해야 한다는 것입니다. 또한, 각 웰에 주입된 미토콘드리아 독소에 노출되면 시간이 지남에 따라 세포 생존력이 더욱 감소할 수 있습니다. 분석이 완료되면 OCR 및 ECAR 판독값을 정규화하기 위해 단백질 함량 평가를 위해 세포를 용해해야 하므로 후속 분자 생물학 분석을 위해 동일한 세포를 수확할 수 없습니다.
생물 에너지 프로파일링을 위한 Seahorse의 대안으로는 Oroboros Oxygraph 2k(O2k)27, BaroFuse28,29 및 Resipher(Lucid Scientific)7가 있습니다. Oroboros O2k는 S1 Clark 유형 폴라로그래픽 산소 전극을 사용하는 폐쇄형 2챔버 호흡계입니다. 오로보로스 O2k는 실시간 대사 플럭스의 매우 민감한 측정을 생성하지만, 이 장치는 작업자가 각 약물(30)을 수동으로 주입해야 하기 때문에 노동 집약적이다. BaroFuse는 가스 압력을 사용하여 다중 병렬 관류 실험을 가능하게 하고 산소 검출 시스템과 연결되어 OCR을 측정하는 새로운 다중 채널 미세 유체 관류 시스템입니다. 이 유동 배양 시스템의 장점은 더 긴 분석에서 세포 생존력이 감소하는 Seahorse와 달리 조직 기능과 생존력이 유지된다는 것입니다. Resipher는 세포가 인큐베이터의 96웰 플레이트에 있는 동안 고감도 광학 산소 센서를 사용하여 OCR을 측정하므로 몇 주에서 몇 달에 걸쳐 지속적인 OCR 측정이 가능합니다. 특히, 이러한 기기는 ECAR을 측정하지 않으므로 Seahorse는 OXPHOS와 해당 과정을 동시에 탐사할 수 있는 이점이 있습니다.
OXPHOS 및 해당 과정의 실시간 생체 에너지 프로파일을 조사하는 것은 RPE 건강 및 기능을 특성화하는 핵심 요소로 부상하고 있습니다. 고분해능 호흡 측정법은 정상 및 질병 RPE의 대사 상태를 비교하는 효율적인 수단을 가능하게 하여 AMD 및 PVR과 같은 망막 질환에 대한 약물 효능을 스크리닝하는 새로운 길을 열어줍니다. RPE에 대한 고분해능 호흡 측정법의 향후 방향에는 트랜스웰 필터에서 성장한 고도로 편광된 RPE 단층에 대한 생체 에너지 프로파일을 검사하기 위한 프로토콜 최적화가 포함됩니다. Calton et al. (2016)은 트랜스웰 필터31에서 성장한 편광 RPE 단층의 삼각형 단면을 절단하여 이를 성공적으로 달성했습니다. 방법론의 추가 확장에는 다양한 망막 퇴행성 질환을 가진 환자로부터 분리된 유도만능줄기세포 유래 RPE(iPSC-RPE)의 생체에너지 프로파일을 조사하는 것이 포함된다 32. AMD 및 PVR에 관여하는 병원성 사이토카인이 RPE 대사의 동적 특성에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 탐구는 새로운 약물 투여 가능한 표적의 식별을 알릴 수 있는 대사 취약성을 밝힐 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 부분적으로 보조금으로 지원되었습니다 : Fight for Sight Leonard & Robert Weintraub Postdoctoral Fellowship (D.Y.S.); 황반변성 연구의 BrightFocus Foundation 박사후 연구원 프로그램(M2021010F, DYS); 국방부, 수상 번호 VR180132(MSG 및 L.A.K.)에 따른 척추 시력 연구 프로그램; 국립 보건원 국립 안과 연구소 수상 번호 R01EY027739(LAK). 이 연구를 지원하기 위해 BrightFocus Foundation의 프로그램인 황반변성 연구 M2021010F의 기증자에게 감사의 말을 전합니다. 회로도는 Biorender.com
2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375-5G | Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection) |
96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile | VWR | 229597 | BCA Assay 96-well plate |
Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma | A8674-25MG | Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone) |
BAM15 | Sigma | SML1760-5MG | Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection) |
BCA Assay | ThermoFisher | 23225 | To determine total protein content in each well |
Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge |
Cell Lysis buffer 10x | Cell Signaling Technologies | 9803S | Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use |
D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection) |
DMSO, Cell culture grade | Sigma-aldrich | D4540-100ML | For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG |
FCCP | Sigma | C2920-10MG | Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection) |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests |
HEPES solution | Sigma | H0887-100ML | Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests |
H-RPE – Human Retinal Pigment Epithelial Cells | Lonza | 194987 | Primary human fetal RPE cells |
Oligomycin – CAS 1404-19-9 – Calbiochem | Sigma | 495455-10MG | ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection) |
Parafilm | Bemis | PM996 | To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor | Gold Biotechnology Inc | 50-153-2823 | Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution |
ReagentPack Subculture Reagents, 100 mL | Lonza | CC-5034 | Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline |
Rotenone | Sigma | R8875-1G | Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A) |
RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit – RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407) | Lonza | 195409 | Media for primary human fetal RPE cells |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | High-Resolution Respirometry Instrument | |
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution |
Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636-100ML | Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media |
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 µm pore size | Millipore-Sigma | SCGP00525 | Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media |
Synergy H1 Plate Reader | BioTek | Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay | |
XF base medium without phenol red | Agilent | 103335-100 | Base media for running the Seahorse assay |