Den metabolske statusen til humane retinale pigmentepitelceller (H-RPE) gjenspeiler deres helse og funksjon. Presentert her er en optimalisert protokoll for å undersøke sanntids metabolsk fluks av H-RPE ved hjelp av høyoppløselig respirometri.
Metabolsk dysfunksjon av retinale pigmentepitelceller (RPE) er en nøkkelpatogen driver for retinale sykdommer som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) og proliferativ vitreoretinopati (PVR). Siden RPE er svært metabolsk aktive celler, gjenspeiler endringer i deres metabolske status endringer i helse og funksjon. Respirometri med høy oppløsning muliggjør kinetisk analyse i sanntid av de to viktigste bioenergetiske banene, glykolyse og mitokondriell oksidativ fosforylering (OXPHOS), gjennom kvantifisering av henholdsvis ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR) og oksygenforbruk (OCR). Følgende er en optimalisert protokoll for å utføre høyoppløselig respirometri på primære humane retinale pigmentepitelceller (H-RPE). Denne protokollen gir en detaljert beskrivelse av trinnene som er involvert i å produsere bioenergetiske profiler av RPE for å definere deres basale og maksimale OXPHOS og glykolytiske kapasiteter. Eksponering av H-RPE for forskjellige legemiddelinjeksjoner rettet mot mitokondrie- og glykolytisk maskineri resulterer i definerte bioenergetiske profiler, hvorfra viktige metabolske parametere kan beregnes. Denne protokollen fremhever den forbedrede responsen til BAM15 som et frakoblingsmiddel sammenlignet med karbonylcyanid p-trifluormetoksyfenylhydrazon (FCCP) for å indusere maksimal respirasjonskapasitet i RPE. Denne protokollen kan brukes til å studere den bioenergetiske statusen til RPE under forskjellige sykdomsforhold og teste effekten av nye legemidler for å gjenopprette den basale metabolske statusen til RPE.
Retinale pigmentepitelceller (RPE) eksisterer som et monolag av pigmenterte epitelceller strategisk plassert mellom fotoreceptorene og fenestrert endotel i choriocapillaris. RPE er svært metabolsk aktive med mange funksjoner, inkludert (1) fagocytose av skurfotoreseptorskiver, (2) resirkulering av visuelt pigment for å opprettholde synssyklusen, (3) transport av næringsstoffer, metabolitter, ioner og vann, (4) absorpsjon av lys, (5) beskyttelse mot fotooksidasjon, (6) sekresjon av essensielle faktorer for å støtte retinal integritet og (7) dannelse av den ytre blod-retinale barrieren1 . Degenerasjon av RPE er assosiert med metabolsk dysfunksjon og mitokondrielle defekter, noe som fører til blindende øyesykdommer som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) og proliferativ vitreoretinopati (PVR)2.
To viktige bioenergetiske veier inkluderer glykolyse, som forekommer i cytoplasma, og oksidativ fosforylering (OXPHOS), som forekommer i mitokondrier. Under glykolyse omdannes ett molekyl glukose til to pyruvatmolekyler og en nettoproduksjon av to molekyler adenosintrifosfat (ATP). I motsetning til glykolyse produserer OXPHOS langt høyere nivåer av ATP (~ 32-38 molekyler ATP per glukosemolekyl). Spesielt forbruker OXPHOS oksygen og krever funksjonelle mitokondrier for å forekomme, mens glykolyse forekommer i cytoplasma og krever ikke oksygen.
Før introduksjonen av fluorescens- eller fosforescensbaserte teknikker for å undersøke mitokondriell respirasjon, ble oksygennivåer målt i permeabiliserte cellesuspensjoner i kamre utstyrt med en Clark-type oksygenelektrode3. Mens Clark-elektroden er mye billigere enn fluorescensbasert respirometri og fungerer i ikke-adherente celler, er den relativt lav gjennomstrømning, med hver respiratorisk kjøring som varer rundt 15-20 minutter og krever langt høyere mengder celler for hver prøve3. Dermed har fluorescensbasert respirometriteknikk i stor grad erstattet Clark-elektroden og har blitt en populær teknikk innen metabolisme og mitokondriell forskning.
Denne protokollen beskriver en høy gjennomstrømning, høyoppløselig, fluorescensbasert respirometriteknikk som kinetisk måler OXPHOS og glykolytiske bioenergetiske profiler av levende celler. Siden prosessen med OXPHOS forbruker oksygen, produseres den bioenergetiske profilen for OXPHOS ved å kartlegge endringer i oksygenforbrukshastigheten (OCR) over tid4. I denne teknikken er to fluoroforer innebygd i sensorpatronhylsen som er koblet til fiberoptiske bunter som avgir lys, spennende fluoroforene. Endringer i fluoroforutslipp måles av svært følsomme fluorescenssensorer og overføres gjennom den fiberoptiske bunten som skal konverteres til en OCR-avlesning5. Fluoroforen blir slukket av oksygen, og muliggjør dermed bestemmelse av ekstracellulære oksygennivåer i analysemediet, kjent som oksygenfluks eller OCR. Den andre fluoroforen er en pH-sensorsonde som er følsom for endringer i protonutstrømning, som omdannes til et mål på ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR). Under målinger senkes de fiberoptiske buntene med innebygde fluoroforer til 200 μm over cellemonolaget, og skaper et forbigående mikrokammer som muliggjør raske sanntidsavlesninger. Når en 10% endring i oksygen- eller protonnivåer oppdages, løftes sensorene oppover, slik at et større volum media blandes med det forbigående mikrokammermediet, og gjenoppretter OCR- og EAR-verdier tilbake til baseline. Hver sensorpatron er utstyrt med fire porter for å muliggjøre sekvensiell administrering av opptil fire forbindelser per brønn under analysen. Målinger kan samles før og etter injeksjon av forbindelsene i hver port, og avslører nøkkelinformasjon om cellens metabolske status.
Å undersøke disse to forskjellige metabolske veiene kan gi viktige funn angående metabolsk status for RPE etter eksponering for forskjellige patogene stimuli, og kan dermed brukes til å teste effekten av legemidler for å gjenopprette den metabolske integriteten til RPE 6,7,8. Fremkomsten av respirometri med høy gjennomstrømning og tilgjengeligheten av spesifikke mitokondriehemmere har stimulert mer forskning i å definere de bioenergetiske profilene til RPE og identifisere defekter i metabolisme og mitokondrier under sykdomstilstander 6,7,8,9,10,11,12,13 . Høyoppløselig respirometri har fremhevet nøkkelrollen som metabolsk omprogrammering av RPE i retinale patologier som AMD og PVR. To viktige cytokiner involvert i patogenesen av AMD og PVR transformerer vekstfaktor-beta 2 (TGFβ2) og tumornekrosefaktor-alfa (TNFα). Induksjonen av epitel-mesenkymal overgang (EMT) ved TGFβ2 ledsages av mitokondriell dysfunksjon, OXPHOS-undertrykkelse og en kompensatorisk økning i glykolytisk kapasitet i RPE6. Mer nylig har det proinflammatoriske cytokinet, TNFα, vist seg å indusere en signifikant oppregulering av basal OXPHOS og redusert glykolyse i H-RPE7. Administrering av dimetylfumarat undertrykte signifikant TNFa-indusert betennelse i H-RPE og gjenopprettet mitokondriell morfologi og basale bioenergetiske profiler7. De divergerende metabolske profilene indusert av disse to vekstfaktorene stimulerer spennende mekanistiske spørsmål angående involvering av metabolsk omprogrammering i retinale sykdommer. Følgende protokoll beskriver trinnene for å vurdere OXPHOS og glykolytiske bioenergetiske profiler i H-RPE ved bruk av høyoppløselig respirometri.
Denne optimaliserte protokollen for høyoppløselig respirometri av H-RPE innebærer bruk av BAM15 som frakobling i stedet for den vanlige FCCP. Mens tidligere studier på høyoppløselig respirometri av RPE benyttet FCCP 9,24, synes BAM15 å indusere en mer robust induksjon av maksimale respirasjonsnivåer i H-RPE sammenlignet med FCCP. Mens både FCCP og BAM15 er trygge å bruke i celler, er BAM15 rapportert å ha færre bivirkninger i normale celler sammenlignet med FCCP eller karbonylcyanid-3-klorfenylhydrazon (CCCP) 25. Kenwood et al. viste at BAM15 depolariserer mitokondrier uten å påvirke plasmamembranpotensialet, og induserer dermed en vedvarende maksimal mitokondriell respirasjonshastighet ved lav cytotoksisitet26. FCCP, derimot, depolariserer både mitokondrier og plasmamembranen og viser høyere cytotoksisitet26.
Det er flere kritiske trinn i protokollen, inkludert å sikre at cellene er riktig belagt i et konfluerende, jevnt og homogent monolag av RPE i alle eksperimentelle brønner på mikroplaten. Eldre RPE er svært avhengige av OXPHOS for energiproduksjon, og dermed bør cellene få lov til å modnes i minst 1 måned for å sikre at RPE genererer riktige basale og maksimale OCR-avlesninger under analysen. Avgassing av cellekulturplaten i 1 time ved 37 °C i en fuktet ovn (uten CO 2) før den plasseres i instrumentet, er avgjørende for nøyaktige EAR-avlesninger, da CO2 kan påvirke pH i analysemediet. Det er viktig å huske å hydrere sensorkassetten dagen før analysen for å sikre at den gir pålitelige OCR- og ECAR-avlesninger på analysedagen. Det må utvises forsiktighet for å rekonstituere legemidlene som skal injiseres på riktig måte, og lagre de rekonstituerte lagrene i mindre volumer for langtidsoppbevaring for å minimere fryse-/tinesykluser. Det er avgjørende å forberede 10x legemiddelløsninger som er fortynnet i de respektive analysemediene (f.eks. fortynnet i Mito Stress Test analysemedier for Mito Stress Test) for å faktor i fortynningen fra injeksjon av legemidlet i hver brønn fylt med analysemedier. Ved hver påfølgende legemiddelinjeksjon er det flere medier i hver brønn, og dermed øker volumene av legemiddel som lastes med hver injeksjon, og det bør utvises forsiktighet for å følge volumene som er spesifisert i protokollen. Det er viktig å utføre kvalitetskontroller når eksperimentet er fullført ved å undersøke sensorkassetten for å sikre at det ikke er noe gjenværende legemiddel og observere cellekulturplaten under et mikroskop for å sikre at det konfluente og homogene cellemonolaget forblir.
Endringer i denne protokollen inkluderer injeksjon av forskjellige stoffer i portene og bestemmelse av hvordan disse stoffene påvirker OCR- og ECAR-avlesninger. En populær modifikasjon er å injisere et eksperimentelt stoff av valget som port A før injisere de vanlige Mito eller glykolytisk stresstest narkotika. Denne typen protokoll gir innsikt i hvordan en akutt injeksjon av det valgte legemidlet påvirker de påfølgende OXPHOS- og glykolytiske parametrene. Andre modifikasjoner inkluderer å undersøke forskjellige celletyper; Dette krever innledende feilsøking av optimal såcelletetthet og optimalisering av analysemediet ved å sikre at basale avlesninger varierer fra 50-100 pmol/min for OCR og 10-20 mpH/min for ECAR. De optimale konsentrasjonene av de injiserte legemidlene må bestemmes for hver ny celletype som undersøkes ved å observere OCR- og EAR-responsene på en seriell fortynning av legemidlene.
En viktig begrensning i protokollen er at cellens levedyktighet reduseres over tid, da cellene ikke er i en CO2 -inkubator i deres normale vekstmedier, og dermed bør analysen fullføres innen 3-4 timer for å sikre maksimal celle levedyktighet. Videre kan eksponering for mitokondrielle toksiner injisert i hver brønn ytterligere redusere cellens levedyktighet over tid. Når analysen er fullført, må cellene lyseres for evaluering av proteininnholdet for å normalisere OCR- og EAR-avlesninger, og dermed kan de samme cellene ikke høstes for senere molekylærbiologiske analyser.
Alternativer til Seahorse for bioenergetisk profilering inkluderer Oroboros Oxygraph 2k (O2k) 27, BaroFuse28,29 og Resipher (Lucid Scientific)7. Oroboros O2k er et lukket tokammer respirometer som benytter S1 Clark-type polarografiske oksygenelektroder. Mens Oroboros O2k produserer svært følsomme målinger av sanntids metabolsk fluks, er enheten arbeidsintensiv da operatøren er pålagt å injisere hvert legemiddelmanuelt 30. BaroFuse er et nytt flerkanals mikrofluidisk perfusjonssystem som bruker gasstrykk for å muliggjøre flere parallelle perfusjonseksperimenter og er knyttet til et oksygendeteksjonssystem for å måle OCR. Fordelen med dette strømningskultursystemet er at vevsfunksjon og levedyktighet opprettholdes, i motsetning til Seahorse hvor cellenes levedyktighet reduseres over lengre analyser. Resipher bruker svært følsomme optiske oksygensensorer for å måle OCR mens cellene er i en 96-brønnsplate i inkubatoren, og muliggjør dermed kontinuerlige OCR-målinger over flere uker til måneder. Disse instrumentene måler ikke ECAR, og dermed har Seahorse fordelen av samtidig utforskning av både OXPHOS og glykolyse.
Å undersøke bioenergetiske profiler av OXPHOS og glykolyse i sanntid fremstår som en nøkkelfaktor for å karakterisere RPEs helse og funksjon. Høyoppløselig respirometri muliggjør et effektivt middel for å sammenligne metabolsk status for normal og syk RPE, og dermed åpne nye veier for screening av legemiddeleffekt for retinale sykdommer som AMD og PVR. Fremtidige retninger for høyoppløselig respirometri på RPE inkluderer optimalisering av en protokoll for å undersøke bioenergetiske profiler for høyt polariserte RPE-monolag dyrket på transbrønnfiltre. Calton et al. (2016) oppnådde dette ved å kutte en trekantet del av det polariserte RPE-monolaget dyrket på transbrønnfiltre31. Ytterligere utvidelse av metodikken inkluderer undersøkelse av bioenergetiske profiler av indusert pluripotent stamcelleavledet RPE (iPSC-RPE), isolert fra pasienter med forskjellige retinale degenerative tilstander32. Utforskning av hvordan patogene cytokiner involvert i AMD og PVR påvirker den dynamiske naturen til RPE-metabolisme, kan avsløre metabolske sårbarheter som kan informere identifiseringen av nye medisinerbare mål.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble delvis støttet av tilskudd fra: Fight for Sight Leonard & Robert Weintraub Postdoctoral Fellowship (DYS); BrightFocus Foundation postdoktorale stipendprogram i makuladegenerasjonsforskning (M2021010F, D.Y.S.); Forsvarsdepartementet, Spinal Vision Research Program under Award nr. VR180132 (MS-G. og LAKE); National Eye Institute of National Institutes of Health under Award nr. R01EY027739 (LAKE). Anerkjennelse gis til giverne av Macular Degeneration Research M2021010F, et program fra BrightFocus Foundation, for støtte til denne forskningen. Skjemaer ble opprettet med Biorender.com
2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375-5G | Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection) |
96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile | VWR | 229597 | BCA Assay 96-well plate |
Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma | A8674-25MG | Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone) |
BAM15 | Sigma | SML1760-5MG | Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection) |
BCA Assay | ThermoFisher | 23225 | To determine total protein content in each well |
Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge |
Cell Lysis buffer 10x | Cell Signaling Technologies | 9803S | Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use |
D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection) |
DMSO, Cell culture grade | Sigma-aldrich | D4540-100ML | For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG |
FCCP | Sigma | C2920-10MG | Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection) |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests |
HEPES solution | Sigma | H0887-100ML | Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests |
H-RPE – Human Retinal Pigment Epithelial Cells | Lonza | 194987 | Primary human fetal RPE cells |
Oligomycin – CAS 1404-19-9 – Calbiochem | Sigma | 495455-10MG | ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection) |
Parafilm | Bemis | PM996 | To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor | Gold Biotechnology Inc | 50-153-2823 | Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution |
ReagentPack Subculture Reagents, 100 mL | Lonza | CC-5034 | Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline |
Rotenone | Sigma | R8875-1G | Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A) |
RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit – RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407) | Lonza | 195409 | Media for primary human fetal RPE cells |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | High-Resolution Respirometry Instrument | |
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution |
Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636-100ML | Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media |
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 µm pore size | Millipore-Sigma | SCGP00525 | Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media |
Synergy H1 Plate Reader | BioTek | Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay | |
XF base medium without phenol red | Agilent | 103335-100 | Base media for running the Seahorse assay |