Flotationsbaseret T-celleisolering, aktivering og ekspansion fra mononukleære celleprøver fra humant perifert blod ved hjælp af mikrobobler

Summary

Formålet med denne undersøgelse er at demonstrere muligheden for flotationsbaseret adskillelse for at isolere, aktivere og udvide primære humane T-celler.

Abstract

Processen med at isolere T-celler fra mononukleære celler i perifert blod (PBMC’er) for at etablere ex vivo-kulturer er afgørende for forskning, klinisk testning og cellebaserede terapier. I denne undersøgelse præsenteres en enkel, ny protokol til at isolere, aktivere og udvide T-celler fra PBMC’er ex vivo . Denne undersøgelse anvender funktionaliseret opdriftsaktiveret cellesorteringsteknologi (BACS) til at isolere og aktivere T-celler. Kort fortalt involverer protokollen den positive udvælgelse af CD3⁺ celler fra leukopak-afledte PBMC’er efterfulgt af en 48 timers co-stimulering med prækonjugerede anti-CD28-bundne streptavidinmikrobobler (SAMB’er) før transduktion i 24-brøndsplader. Funktionaliserede mikrobobler giver en unik mulighed for at aktivere celler flydende, hvilket fører til proliferative fænotyper, der giver mulighed for ekspansion med minimal udmattelse. Denne teknik giver reduceret udmattelse, fordi de co-stimulerende mikrobobler forbliver flydende og vender tilbage til toppen af dyrkningsmediet, hvilket reducerer den tid, de ekspanderende celler er i kontakt med de co-stimulerende faktorer. Resultaterne indikerer, at de isolerede og dyrkede T-celler modtager tilstrækkelig stimulering til at aktivere og proliferere, men ikke i et omfang, der fører til overaktivering, hvilket derefter fører til udmattelse, som det fremgår af tilstedeværelsen af overdreven PD-1.

Introduction

Mere end 500 kliniske forsøg med kimær antigenreceptor (CAR)-T-celleterapi udføres i øjeblikket over hele verden, og fire CAR-T-celleterapiprodukter er tilgængelige på markedet¹. Imidlertid eksisterer der stadig adskillige CAR-T-celleforsknings- og fremstillingsbehov, der skal løses for at forbedre effektiviteten, skalerbarheden og den langsigtede succes for disse potentielt helbredende terapier 2,3,4,5. Adoptiv CAR-T-celle klinisk forskning og fremstilling begynder med T-celleisolering fra en perifer blodprøve og den efterfølgende stimulering, transduktion og udvidelse af de isolerede celler. Parametre som T-cellegendannelse, renhed og aktiverings-/udmattelsessignaler kræver nøje overvejelse, når man vælger celleisolations- og stimuleringsteknikker til CAR-T-celleforskning og fremstilling ^3,4,6. Det er vigtigt, at forbedring af den terapeutiske persistens af CAR-T-celleterapier ved at minimere de biologiske hindringer, der skyldes de nuværende fremstillingsprocesser, såsom T-celleudmattelse, er nødvendig for at forbedre den terapeutiske effekt ^6,7.

Som et alternativ til traditionelle celleisoleringsmetoder såsom fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) demonstreres her opdriftsaktiveret cellesortering (BACS) med mikrobobler til T-celleisolering. Mikrobobleseparation bruger flydende, hule mikrosfærer (mikrobobler) til at binde målene og flyde dem til overfladen af væskeprøver ^8,9. Ved at funktionalisere mikrobobler med antistoffer (dvs. anti-CD3) kan de ønskede T-cellepopulationer vælges positivt fra perifere blodprøver. Efterfølgende demonstreres brugen af en anden population af antistoffunktionaliserede mikrobobler (dvs. anti-CD28) til at co-stimulere og aktivere positivt udvalgte T-celler i suspension i dette arbejde. Mikrobobler tilbyder en enkel og meget justerbar isolations- og aktiveringsarbejdsgang, der genererer T-celler klar til suspenderet cellekultur og downstream-applikationer såsom genetisk modifikation og ekspansion. Kritisk fremmer flydende celleaktivering med mikrobobler tilbageholdt cellestimulering for at forhindre overdreven T-celleudmattelse⁷.

Til denne undersøgelse var flowcytometri det primære værktøj, der blev brugt til at analysere isolation, aktivering og transduktionssucces for de funktionaliserede mikrobobler samt til at give detaljerede oplysninger om de specifikke subpopulationer, der var til stede under vækst- og ekspansionsfaserne efter transduktion. Ud over flowcytometri blev brightfield- og fluorescensmikroskopi brugt til at bekræfte cellesundhed, morfologi og transduktionssucces. Baseret på disse resultater giver mikrobobleteknologien og protokollen et mere justerbart og blidere alternativ til de traditionelle isolations- og aktiveringsmetoder, der i øjeblikket anvendes i dag; især mikrobobleaktiverede celler viser især lavere ekspression af T-celleudmattelsesmarkører end den, der typisk observeres med industristandardværktøjer og -sæt.

Protocol

1. Isolering af T-celler med mikrobobler ved hjælp af positiv selektion BEMÆRK: Denne protokol beskriver en lille CD3+ positiv udvælgelsesmetode ved hjælp af SAMB’er. Inkuber 3 x 108 kommercielt opnåede PBMC’er i 2,5 ml separationsbuffer med biotinyleret anti-CD3 (OKT3) antistof i en koncentration på 25 ng antistof pr. 1 million celler (25 ng/M). Bland forsigtigt ved pipettering op og ned, og inkuber ved stuetemperatur i 10 min. …

Representative Results

T-celler blev isoleret fra købte PBMC’er og belagt til aktivering som beskrevet i protokollen. De negative kontrolprøver (købte PBMC’er) blev ikke aktiveret. Disse kontrolprøver blev inkluderet for at demonstrere den effekt, som mikrobobleaktiveringsprocessen havde på de eksperimentelle prøver sammenlignet med de uberørte og ustimulerede T-cellekontroller, hvilket sikrede, at de observerede aktiveringsmarkører var resultatet af de tilføjede aktiveringsfaktorer og ikke var iboende for T-cellerne selv. I henhold t…

Discussion

Den beskrevne protokol giver mulighed for isolering af T-celler fra PBMC-prøver og aktivering af suspenderede T-celler i kulturmedier med mikrobobler. Denne metode er afhængig af funktionaliserede mikrobobler, hvis iboende opdrift giver en unik mulighed for at introducere co-stimulerende signaler til celler og aktivere dem, mens de suspenderes i et dyrkningsmedium, hvorved de ekspanderende cellers eksponering for langvarig stimulering reduceres; sådan overstimulering kan resultere i øget ekspression af T-celleudmatte…

Materials

2-Mercaptoethanol	Gibco	21985-023	CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates	VWR	76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody	Biolegend	302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody	Biolegend	317320
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-136
GlutaMAX Supplement	Thermofisher	35050061
Human Recombinant IL2	BioVision (vwr)	10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9	Takara Bio	0038VCT
Leukopak	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs	BioIVT	HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture	VWR	97063-708	CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated	Innovative Research	ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES	Gibco	72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer)	Akadeum	11110-000