माइक्रोबबल का उपयोग करके मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल नमूनों से प्लवनशीलता-आधारित टी सेल अलगाव, सक्रियण और विस्तार
Summary
इस अध्ययन का उद्देश्य प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं को अलग करने, सक्रिय करने और विस्तार करने के लिए प्लवनशीलता-आधारित पृथक्करण की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करना है।
Abstract
पूर्व विवो संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से टी कोशिकाओं को अलग करने की प्रक्रिया अनुसंधान, नैदानिक परीक्षण और सेल-आधारित उपचारों के लिए महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन में, पीबीएमसी एक्स विवो से टी कोशिकाओं को अलग करने, सक्रिय करने और विस्तारित करने के लिए एक सरल, नया प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह अध्ययन टी कोशिकाओं को अलग करने और सक्रिय करने के लिए कार्यात्मक उछाल-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (बीएसीएस) तकनीक का उपयोग करता है। संक्षेप में, प्रोटोकॉल में ल्यूकोपाक-व्युत्पन्न पीबीएमसी से सीडी 3 + कोशिकाओं का सकारात्मक चयन शामिल है, इसके बाद 24-वेल प्लेटों में पारगमन से पहले पूर्व-संयुग्मित एंटी-सीडी 28-बाउंड स्ट्रेप्टाविडिन माइक्रोबबल्स (एसएएमबी) के साथ 48 घंटे की सह-उत्तेजना होती है। कार्यात्मक माइक्रोबबल कोशिकाओं को सक्रिय करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करते हैं, जिससे प्रोलिफेरेटिव फेनोटाइप होते हैं जो न्यूनतम थकावट के साथ विस्तार की अनुमति देते हैं। यह तकनीक कम थकावट प्रदान करती है क्योंकि सह-उत्तेजक माइक्रोबबलउत्तेजित रहते हैं और संस्कृति माध्यम के शीर्ष पर वापस आ जाते हैं, इस प्रकार विस्तारित कोशिकाओं को सह-उत्तेजक कारकों के संपर्क में आने वाले समय की मात्रा कम हो जाती है। परिणाम बताते हैं कि पृथक और सुसंस्कृत टी कोशिकाओं को सक्रिय और प्रसार के लिए पर्याप्त उत्तेजना प्राप्त होती है, लेकिन उस हद तक नहीं जो अतिसक्रियण की ओर जाता है, जो तब थकावट की ओर जाता है, जैसा कि अत्यधिक पीडी -1 की उपस्थिति से प्रदर्शित होता है।
Introduction
500 से अधिक चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर)-टी सेल थेरेपी नैदानिक परीक्षण वर्तमान में दुनिया भर में आयोजित किए जा रहे हैं, और चार सीएआर-टी सेल थेरेपी उत्पाद बाजारपर उपलब्ध हैं। हालांकि, कई सीएआर-टी सेल अनुसंधान और विनिर्माण आवश्यकताएं अभी भी मौजूद हैं जिन्हें इन संभावित उपचारात्मक उपचारों 2,3,4,5 की प्रभावकारिता, मापनीयता और दीर्घकालिक सफलता में सुधार के लिए संबोधित किया जाना चाहिए। दत्तक सीएआर-टी सेल नैदानिक अनुसंधान और विनिर्माण परिधीय रक्त नमूने से टी सेल अलगाव और बाद में उत्तेजना, पारगमन और पृथक कोशिकाओं के विस्तार के साथ शुरू होता है। टी सेल रिकवरी, शुद्धता और सक्रियण / थकावट संकेतों जैसे मापदंडों को सीएआर-टी सेल अनुसंधान और विनिर्माण 3,4,6 के लिए सेल अलगाव और उत्तेजनातकनीकों का चयन करते समय सावधानीपूर्वक विचार करने की आवश्यकता होती है। महत्वपूर्ण रूप से, चिकित्सीय प्रभावकारिता 6,7 को बढ़ाने के लिए वर्तमान विनिर्माण प्रक्रियाओं, जैसे टी सेल थकावट के परिणामस्वरूप जैविक बाधाओं को कम करके सीएआर-टी सेल थेरेपी की चिकित्सीय दृढ़ता में सुधार की आवश्यकता है।
पारंपरिक सेल अलगाव विधियों जैसे फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) और चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) के विकल्प के रूप में, यहां, टी सेल अलगाव के लिए माइक्रोबबल के साथ उछाल-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (बीएसीएस) का प्रदर्शन किया जाता है। माइक्रोबबल पृथक्करण लक्ष्यों को बांधने और उन्हें द्रव नमूने 8,9 की सतह पर तैरने के लिए उत्प्लावन, खोखले माइक्रोसेफर्स (माइक्रोबबल) का उपयोग करता है। एंटीबॉडी (यानी, एंटी-सीडी 3) के साथ माइक्रोबबल को कार्यात्मक बनाकर, वांछित टी सेल आबादी को परिधीय रक्त नमूनों से सकारात्मक रूप से चुना जा सकता है। इसके बाद, निलंबन में सकारात्मक रूप से चयनित टी कोशिकाओं को सह-उत्तेजित और सक्रिय करने के लिए एंटीबॉडी-कार्यात्मक माइक्रोबबल (यानी, एंटी-सीडी 28) की एक अलग आबादी का उपयोग इस काम में प्रदर्शित किया गया है। माइक्रोबबलएक सरल और अत्यधिक अक्षम अलगाव और सक्रियण वर्कफ़्लो प्रदान करते हैं जो निलंबित सेल संस्कृति और अनुवांशिक संशोधन और विस्तार जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए तैयार टी कोशिकाओं को उत्पन्न करता है। गंभीर रूप से, माइक्रोबबल्स के साथ उत्प्लावन सेल सक्रियण अत्यधिक टी सेल थकावट को रोकने के लिए संयमित सेल उत्तेजना को बढ़ावादेता है।
इस अध्ययन के लिए, फ्लो साइटोमेट्री प्राथमिक उपकरण था जिसका उपयोग कार्यात्मक माइक्रोबबल्स के अलगाव, सक्रियण और पारगमन की सफलता का विश्लेषण करने के साथ-साथ ट्रांसडक्शन के बाद विकास और विस्तार चरणों के दौरान मौजूद विशिष्ट उप-आबादी के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करने के लिए किया जाता था। फ्लो साइटोमेट्री के अलावा, सेल स्वास्थ्य, आकृति विज्ञान और पारगमन सफलता की पुष्टि करने के लिए ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया था। इन परिणामों के आधार पर, माइक्रोबबल तकनीक और प्रोटोकॉल वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक अलगाव और सक्रियण विधियों के लिए एक अधिक असमर्थ और सौम्य विकल्प प्रदान करते हैं; विशेष रूप से, माइक्रोबबल-सक्रिय कोशिकाएं टी सेल थकावट मार्करों की विशेष रूप से कम अभिव्यक्ति दिखाती हैं जो आमतौर पर उद्योग-मानक उपकरणों और किट के साथ देखी जाती हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल पीबीएमसी नमूनों से टी कोशिकाओं के अलगाव और माइक्रोबबल के साथ संस्कृति मीडिया में निलंबित टी कोशिकाओं के सक्रियण की अनुमति देता है। यह विधि कार्यात्मक माइक्रोबबल्स पर निर्भर करती ह?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोई नहीं।
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
Referências
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