Uso de microscopia Time-Lapse e Depleção Nuclear Específica de Estágio de Proteínas para Estudo da Meiose em S. cerevisiae

Gisela Cairo; Anne MacKenzie; Dai Tsuchiya; Soni Lacefield

doi:10.3791/64580

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Artigo de método

Uso de microscopia Time-Lapse e Depleção Nuclear Específica de Estágio de Proteínas para Estudo da Meiose em S. cerevisiae

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DOI:

10.3791/64580

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11 de outubro de 2022

Gisela Cairo^*¹ , Anne MacKenzie^*¹ , Dai Tsuchiya¹^,² , Soni Lacefield¹

¹Department of Biology, Indiana University, ²Stowers Institute for Biomedical Research

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A microscopia de lapso de tempo é uma ferramenta valiosa para estudar a meiose em leveduras em brotamento. Este protocolo descreve um método que combina sincronização do ciclo celular, microscopia de lapso de tempo e depleção condicional de uma proteína-alvo para demonstrar como estudar a função de uma proteína específica durante a segregação cromossômica meiótica.

Resumo

A microscopia de fluorescência de lapso de tempo revolucionou a compreensão dos eventos do ciclo celular meiótico, fornecendo dados temporais e espaciais que muitas vezes não são vistos por imagens de células fixas. A levedura em brotamento provou ser um importante organismo modelo para estudar a segregação cromossômica meiótica, porque muitos genes meióticos são altamente conservados. A microscopia de lapso de tempo da meiose em levedura em brotamento permite o monitoramento de diferentes mutantes meióticos para mostrar como a mutação interrompe os processos meióticos. No entanto, muitas proteínas funcionam em vários pontos da meiose. O uso de mutantes nulos meióticos ou meióticos pode, portanto, interromper um processo precoce, bloqueando ou perturbando o processo posterior e dificultando a determinação dos fenótipos associados a cada papel individual. Para contornar esse desafio, este protocolo descreve como as proteínas podem ser condicionalmente esgotadas do núcleo em estágios específicos da meiose enquanto monitoram eventos meióticos usando microscopia de lapso de tempo. Especificamente, este protocolo descreve como as células são sincronizadas na prófase I, como a técnica de ancoragem é usada para esgotar proteínas do núcleo em estágios meióticos específicos e como a imagem de lapso de tempo é usada para monitorar a segregação cromossômica meiótica. Como exemplo da utilidade da técnica, a proteína cinetócora Ctf19 foi esgotada do núcleo em diferentes momentos durante a meiose, e o número de massas de cromatina foi analisado no final da meiose II. No geral, este protocolo pode ser adaptado para esgotar diferentes proteínas nucleares do núcleo enquanto monitora as divisões meióticas.

Introdução

A microscopia de fluorescência time-lapse é uma ferramenta valiosa para o estudo da dinâmica da segregação cromossômica meiótica em leveduras em brotamento ^1,2. As células de levedura em brotamento podem ser induzidas a sofrer meiose através da fome de nutrientes essenciais³. Durante a meiose, as células passam por uma rodada de segregação cromossômica seguida de duas divisões para criar quatro produtos meióticos que são embalados em esporos (Figura 1). Células individuais podem ser visualizadas ao longo de cada estágio da meiose, o que gera dados espaciais....